304 o gydrannau cemegol tiwbiau coil dur di-staen, Mae strwythur yr ectodomain SPACA6 yn cynnwys superteulu gwarchodedig o broteinau sy'n gysylltiedig ag ymasiad gamet.

Diolch am ymweld â Nature.com.Rydych chi'n defnyddio fersiwn porwr gyda chefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn ogystal, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, rydym yn dangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Sliders yn dangos tair erthygl fesul sleid.Defnyddiwch y botymau cefn a nesaf i symud trwy'r sleidiau, neu'r botymau rheolydd sleidiau ar y diwedd i symud trwy bob sleid.

Mae SPACA6 yn brotein arwyneb a fynegir gan sberm sy'n hanfodol ar gyfer ymasiad gametau yn ystod atgenhedlu rhywiol mamalaidd.Er gwaethaf y rôl sylfaenol hon, nid oes llawer o ddealltwriaeth o swyddogaeth benodol SPACA6.Rydym yn egluro strwythur grisial parth allgellog SPACA6 ar gydraniad o 2.2 Å, gan ddatgelu protein dau barth sy'n cynnwys bwndel pedwar llinyn a brechdanau β tebyg i Ig ynghyd â chysylltwyr lled-hyblyg.Mae'r strwythur hwn yn debyg i IZUMO1, protein arall sy'n gysylltiedig ag ymasiad gamet, sy'n gwneud SPACA6 ac IZUMO1 yn aelodau sefydlu o'r superteulu o broteinau sy'n gysylltiedig â ffrwythloni y cyfeirir atynt yma fel yr uwchdeulu IST.Mae'r uwchdeulu IST wedi'i ddiffinio'n strwythurol gan ei fwndel pedwar helics troellog a phâr o fotiffau CXXC sy'n gysylltiedig â disulfide.Fe wnaeth chwiliad AlphaFold ar sail strwythur o'r proteome dynol ganfod aelodau protein ychwanegol o'r uwchdeulu hwn;yn nodedig, mae llawer o'r proteinau hyn yn ymwneud ag ymasiad gametau.Mae strwythur SPACA6 a'i berthynas ag aelodau eraill o'r uwchdeulu IST yn darparu'r ddolen goll yn ein gwybodaeth am ymasiad gametau mamalaidd.
Mae pob bywyd dynol yn dechrau gyda dau gamet haploid ar wahân: sberm y tad ac wy y fam.Mae'r sberm hwn yn enillydd proses ddethol ddwys lle mae miliynau o gelloedd sberm yn mynd trwy'r llwybr genital benywaidd, yn goresgyn rhwystrau amrywiol1 ac yn cael cynhwysiant, sy'n gwella eu symudedd a'r broses o gydrannau arwyneb2,3,4.Hyd yn oed os yw'r sberm a'r oocyt yn dod o hyd i'w gilydd, nid yw'r broses ar ben eto.Mae'r oocyt wedi'i amgylchynu gan haen o gelloedd cwwlws a rhwystr glycoprotein a elwir yn zona pellucida, y mae'n rhaid i sberm basio drwyddo i fynd i mewn i'r öosyt.Mae sbermatosoa yn defnyddio cyfuniad o foleciwlau adlyniad arwyneb ac ensymau sy'n gysylltiedig â philen ac wedi'u secretu i oresgyn y rhwystrau terfynol hyn5.Mae'r moleciwlau a'r ensymau hyn yn cael eu storio'n bennaf yn y bilen fewnol a'r matrics acrosomaidd a chânt eu canfod pan fydd pilen allanol y sberm yn lysed yn ystod yr adwaith acrosomaidd6.Y cam olaf yn y daith ddwys hon yw’r digwyddiad ymasiad sberm-wy, lle mae’r ddwy gell yn asio eu pilenni i ddod yn un organeb diploid7.Er bod y broses hon yn torri tir newydd mewn atgenhedlu dynol, ni ddeellir y rhyngweithiadau moleciwlaidd angenrheidiol yn dda.
Yn ogystal â ffrwythloni gametau, mae cemeg cyfuniad dwy haen lipid wedi'i astudio'n helaeth.Yn gyffredinol, mae ymasiad pilen yn broses egniol anffafriol sy'n gofyn am gatalydd protein i newid cydffurfiad strwythurol sy'n dod â dwy bilen yn agosach at ei gilydd, gan dorri eu parhad ac achosi ymasiad8,9.Gelwir y catalyddion protein hyn yn ffiwsogenau ac maent wedi'u canfod mewn systemau ymasiad di-ri.Mae eu hangen ar gyfer mynediad firaol i gelloedd cynnal (ee, gp160 yn HIV-1, pigyn mewn coronafirysau, hemagglutinin mewn firysau ffliw) 10,11,12 brych (syncytin)13,14,15 ac ymasiadau sy'n ffurfio gamet mewn ewcaryotau is ( HAP2/GCS1 mewn planhigion, protestwyr ac arthropodau) 16,17,18,19.Nid yw ffiwsogenau ar gyfer gametau dynol wedi'u darganfod eto, er bod nifer o broteinau wedi'u dangos i fod yn hanfodol ar gyfer atodiad gametau ac ymasiad.Y CD9 a fynegwyd oocyte, protein trawsbilen sydd ei angen ar gyfer ymasiad llygoden a gametau dynol, oedd y cyntaf i'w ddarganfod 21,22,23.Er bod ei union swyddogaeth yn parhau i fod yn aneglur, mae rôl mewn adlyniad, strwythur y ffocws adlyniad ar ficrofili wyau, a/neu leoleiddio proteinau arwyneb oocyt yn gywir yn ymddangos yn debygol 24,25,26.Y ddau brotein mwyaf nodweddiadol sy'n hanfodol ar gyfer ymasiad gamet yw'r protein sberm IZUMO127 a'r protein oocyte JUNO28, ac mae eu cysylltiad â'i gilydd yn gam pwysig wrth adnabod gametau ac adlyniad cyn ymasiad.Mae llygod cnocio Izumo1 gwrywaidd a llygod cnocio Juno benywaidd yn gwbl ddi-haint, yn y modelau hyn mae sberm yn mynd i mewn i'r gofod perivitelline ond nid yw gametau yn ffiwsio.Yn yr un modd, gostyngwyd cydlifiad pan gafodd gametau eu trin â gwrthgyrff gwrth-IZUMO1 neu JUNO27,29 mewn arbrofion ffrwythloni in vitro dynol.
Yn ddiweddar, darganfuwyd grŵp sydd newydd ei ddarganfod o broteinau a fynegir sberm sy'n ffenoteipaidd debyg i IZUMO1 a JUNO20,30,31,32,33,34,35.Mae protein sy'n gysylltiedig â philen acrosomal sberm 6 (SPACA6) wedi'i nodi'n hanfodol ar gyfer ffrwythloni mewn astudiaeth mutagenesis murine ar raddfa fawr.Mae gosod y transgene i'r genyn Spaca6 yn cynhyrchu sbermatosoa na ellir ei ymdoddi, er bod y sbermatosoa hyn yn ymdreiddio i'r gofod perivitelline 36 .Cadarnhaodd astudiaethau cnocio dilynol mewn llygod fod angen Spaca6 ar gyfer ymasiad gamet 30,32 .Mynegir SPACA6 bron yn gyfan gwbl yn y ceilliau ac mae ganddo batrwm lleoleiddio tebyg i un IZUMO1, sef o fewn intima'r sbermatosoa cyn yr adwaith acrosomaidd, ac yna'n mudo i'r rhanbarth cyhydeddol ar ôl yr adwaith acrosomaidd 30,32.Mae homologau Spaca6 yn bodoli mewn amrywiaeth o famaliaid ac ewcaryotau eraill 30 ac mae ei bwysigrwydd ar gyfer ymasiad gamet dynol wedi'i ddangos gan ataliad ffrwythloniad dynol in vitro gan ymwrthedd i SPACA6 30 .Yn wahanol i IZUMO1 a JUNO, mae manylion strwythur, rhyngweithiadau a swyddogaeth SPACA6 yn aneglur o hyd.
Er mwyn deall yn well y broses sylfaenol sy’n sail i ymasiad sberm dynol ac wyau, a fydd yn ein galluogi i lywio datblygiadau yn y dyfodol mewn cynllunio teulu a thriniaeth ffrwythlondeb, cynhaliom astudiaethau strwythurol a biocemegol SPACA6.Mae strwythur grisial parth allgellog SPACA6 yn dangos bwndel pedwar helical (4HB) a pharth tebyg i imiwnoglobwlin (tebyg i Ig) wedi'i gysylltu gan ranbarthau lled-hyblyg.Fel y rhagwelwyd mewn astudiaethau blaenorol, 7,32,37 mae strwythur parth SPACA6 yn debyg i strwythur IZUMO1 dynol, ac mae'r ddau brotein yn rhannu motiff anarferol: 4HB gydag arwyneb helical trionglog a phâr o fotiffau CXXC sy'n gysylltiedig â disulfide.Cynigiwn fod IZUMO1 a SPACA6 bellach yn diffinio uwch-deulu mwy o broteinau sy'n gysylltiedig ag ymasiad gametau â strwythur cysylltiedig.Gan ddefnyddio nodweddion sy'n unigryw i'r uwch-deulu, fe wnaethom ni chwilio'n drylwyr am broteome dynol adeileddol AlphaFold, gan nodi aelodau ychwanegol o'r uwchdeulu hwn, gan gynnwys sawl aelod sy'n ymwneud ag ymasiad gametau a / neu ffrwythloni.Ymddengys bellach fod yna blygiad strwythurol cyffredin a superfamily o broteinau sy'n gysylltiedig ag ymasiad gametau, ac mae ein strwythur yn darparu map moleciwlaidd o'r agwedd bwysig hon ar y mecanwaith ymasiad gamet dynol.
Mae SPACA6 yn brotein trawsbilen un-pas gydag un glycan sy'n gysylltiedig â N a chwe bond disulfide tybiedig (Ffigurau S1a a S2).Rydym yn mynegi y parth allgellog o dynol SPACA6 (gweddillion 27-246) mewn celloedd Drosophila S2 a buro y protein gan ddefnyddio affinedd nicel, cyfnewid catïo, a chromatograffeg gwaharddiad maint ( Ffig. S1b ).Mae'r ectodomain SPACA6 puro yn sefydlog iawn ac yn homogenaidd.Datgelodd dadansoddiad gan ddefnyddio cromatograffaeth eithrio maint ynghyd â gwasgariad golau amlochrog (SEC-MALS) un brig gyda phwysau moleciwlaidd wedi'i gyfrifo o 26.2 ± 0.5 kDa (Ffig. S1c).Mae hyn yn gyson â maint yr ectodomain monomerig SPACA6, sy'n nodi na ddigwyddodd oligomerization yn ystod puro.Yn ogystal, datgelodd sbectrosgopeg dichroism cylchol (CD) strwythur cymysg α/β gyda phwynt toddi o 51.3 °C (Ffig. S1d,e).Datgelodd datgeliad y sbectra CD 38.6% α-helical a 15.8% β-sownd elfennau (Ffigur S1d).
Crisialwyd yr ectodomain SPACA6 gan ddefnyddio hadu matrics ar hap38 gan arwain at set ddata gyda chydraniad o 2.2 Å (Tabl 1 a Ffigur S3).Gan ddefnyddio cyfuniad o amnewidiad moleciwlaidd ar sail darn a data graddol SAD gydag amlygiad bromid ar gyfer pennu adeiledd (Tabl 1 a Ffigur S4), mae'r model mireinio terfynol yn cynnwys gweddillion 27-246.Ar yr adeg y penderfynwyd ar y strwythur, nid oedd unrhyw strwythurau arbrofol nac AlphaFold ar gael.Mae ectodomain SPACA6 yn mesur 20 Å × 20 Å × 85 Å, yn cynnwys saith helices a naw β-linyn, ac mae ganddo blygiad trydyddol hirgul wedi'i sefydlogi gan chwe bond disulfid (Ffig. 1a, b).Mae'r dwysedd electronau gwan ar ddiwedd cadwyn ochr Asn243 yn nodi bod y gweddillion hwn yn glycosyleiddiad sy'n gysylltiedig â N.Mae'r strwythur yn cynnwys dau faes: bwndel pedwar helics N-terminal (4HB) a pharth tebyg i Ig-terminal gyda rhanbarth colfach canolradd rhyngddynt (Ffig. 1c).
a Strwythur parth allgellog SPACA6.Diagram stribed o barth allgellog SPACA6, lliw'r gadwyn o N i derfynfa C o las tywyll i goch tywyll.Mae cysteinau sy'n gysylltiedig â bondiau disulfide yn cael eu hamlygu mewn magenta.b Topoleg parth allgellog SPACA6.Defnyddiwch yr un cynllun lliw ag yn Ffigur 1a.c SPACA6 parth allgellog.Mae'r siartiau stribed parth tebyg i 4HB, colfach ac Ig wedi'u lliwio'n oren, gwyrdd a glas, yn y drefn honno.Nid yw'r haenau'n cael eu tynnu wrth raddfa.
Mae parth 4HB o SPACA6 yn cynnwys pedwar prif helices (helices 1-4), sy'n cael eu trefnu ar ffurf helics helical (Ffig. 2a), yn ail rhwng rhyngweithiadau gwrthbaralel a chyfochrog (Ffig. 2b).Mae helics un tro bach ychwanegol (helix 1′) yn cael ei osod yn berpendicwlar i'r bwndel, gan ffurfio triongl gyda helices 1 a 2. Mae'r triongl hwn wedi'i ddadffurfio ychydig ym mhaciad helical-troellog y pecyn cymharol drwchus o helices 3 a 4 ( Ffig. 2a).
Siart stribedi terfynell N 4HB.b Golygfa uchaf o bwndel o bedwar helices, pob helics wedi'i amlygu mewn glas tywyll yn y N-terminus a choch tywyll ar y C-terminus.c Diagram olwyn troellog o'r brig i lawr ar gyfer 4HB, gyda phob gweddill yn cael ei ddangos fel cylch wedi'i labelu â chod asid amino un llythyren;dim ond y pedwar asid amino ar frig yr olwyn sydd wedi'u rhifo.Mae gweddillion nad ydynt yn begynol wedi'u lliwio'n felyn, mae gweddillion heb eu gwefru pegynol wedi'u lliwio'n wyrdd, mae gweddillion â gwefr bositif wedi'u lliwio'n las, ac mae gweddillion â gwefr negyddol wedi'u lliwio'n goch.d Wynebau trionglog y parth 4HB, gyda 4HBs mewn oren a cholfachau mewn gwyrdd.Mae'r ddau fewnosodiad yn dangos bondiau disulfide siâp gwialen.
Mae 4HB wedi'i ganolbwyntio ar graidd hydroffobig mewnol sy'n cynnwys gweddillion aliffatig ac aromatig yn bennaf (Ffig. 2c).Mae'r craidd yn cynnwys bond disulfide rhwng Cys41 a Cys55 sy'n cysylltu helices 1 a 2 â'i gilydd mewn triongl uwch (Ffig. 2d).Ffurfiwyd dau fond disulfide ychwanegol rhwng y motiff CXXC yn Helix 1′ a motiff CXXC arall a ddarganfuwyd ar flaen y β-hairpin yn y rhanbarth colfach (Ffig. 2d).Mae gweddillion arginine ceidwadol gyda swyddogaeth anhysbys (Arg37) wedi'i leoli y tu mewn i driongl gwag a ffurfiwyd gan helices 1′, 1, a 2. Mae atomau carbon aliffatig Cβ, Cγ, a Cδ Arg37 yn rhyngweithio â'r craidd hydroffobig, ac mae ei grwpiau guanidine yn symud yn gylchol rhwng helices 1′ ac 1 trwy ryngweithio rhwng asgwrn cefn Thr32 a'r gadwyn ochr (Ffig. S5a,b).Mae Tyr34 yn ymestyn i mewn i'r ceudod gan adael dau geudod bach y gall Arg37 ryngweithio â'r toddydd trwyddynt.
Mae parthau β-rhyngosod tebyg i Ig yn uwchdeulu mawr o broteinau sy'n rhannu'r nodwedd gyffredin o ddwy neu fwy o ddalennau β amffipathig aml-linyn yn rhyngweithio trwy graidd hydroffobig 39. Mae gan barth tebyg i Ig-terminal C o SPACA6 yr un patrwm ac yn cynnwys dwy haen (Ffig. S6a).Mae dalen 1 yn daflen β o bedwar llinyn (ceinciau D, F, H, ac I) lle mae ceinciau F, H, ac I yn ffurfio trefniant gwrth-gyfochrog, ac mae llinynnau I a D yn cymryd rhyngweithiad paralel.Mae Tabl 2 yn ddalen beta llinyn dwbl gwrth-gyfochrog fach (llinynnau E a G).Arsylwyd bond disulfide mewnol rhwng y C-terminus y gadwyn E a chanol y gadwyn H (Cys170-Cys226) (Ffig. S6b).Mae'r bond disulfide hwn yn cyfateb i'r bond disulfide ym mharth β-rhyngosod imiwnoglobwlin40,41.
Mae'r dalen β pedair llinyn yn troi ar ei hyd cyfan, gan ffurfio ymylon anghymesur sy'n wahanol o ran siâp ac electrostatig.Mae'r ymyl teneuach yn arwyneb amgylcheddol hydroffobig gwastad sy'n sefyll allan o'i gymharu â'r arwynebau anwastad ac amrywiol yn electrostatig yn SPACA6 (Ffig. S6b,c).Mae halo o garbonyl asgwrn cefn agored / grwpiau amino a chadwyni ochr pegynol amgylchynu'r wyneb hydroffobig ( Ffig. S6c ).Mae'r ymyl ehangach wedi'i orchuddio gan segment helical wedi'i gapio sy'n blocio'r rhan N-derfynell o'r craidd hydroffobig ac yn ffurfio tri bond hydrogen gyda grŵp pegynol agored asgwrn cefn y gadwyn F (Ffig. S6d).Mae rhan terfynell C yr ymyl hon yn ffurfio poced fawr gyda chraidd hydroffobig rhannol agored.Mae'r poced wedi'i amgylchynu gan daliadau positif oherwydd tair set o weddillion arginine dwbl (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ac Arg212-Arg214) a histidine canolog (His220) (Ffigur S6e).
Mae'r rhanbarth colfach yn segment byr rhwng y parth helical a'r parth tebyg i Ig, sy'n cynnwys un haen β tair-linyn gwrthgyfochrog (llinynnau A, B ac C), helics bach 310, a sawl segment helical hir ar hap.(Ffig. S7).Mae'n ymddangos bod rhwydwaith o gysylltiadau cofalent ac electrostatig yn y rhanbarth colfach yn sefydlogi'r cyfeiriadedd rhwng 4HB a'r parth tebyg i Ig.Gellir rhannu'r rhwydwaith yn dair rhan.Mae'r rhan gyntaf yn cynnwys dau fotiff CXXC (27CXXC30 a 139CXXC142) sy'n ffurfio pâr o fondiau disulfide rhwng y β-hairpin yn y colfach a'r helics 1′ yn 4HB.Mae'r ail ran yn cynnwys rhyngweithiadau electrostatig rhwng y parth tebyg i Ig a'r colfach.Mae Glu132 yn y colfach yn ffurfio pont halen gydag Arg233 yn y parth tebyg i Ig ac Arg135 yn y colfach.Mae'r drydedd ran yn cynnwys bond cofalent rhwng y parth tebyg i Ig a'r rhanbarth colfach.Mae dau fond disulfide (Cys124-Cys147 a Cys128-Cys153) yn cysylltu'r ddolen colfach i gysylltydd sy'n cael ei sefydlogi gan ryngweithiadau electrostatig rhwng Gln131 a'r grŵp swyddogaethol asgwrn cefn, gan ganiatáu mynediad i'r parth tebyg i Ig cyntaf.cadwyn.
Defnyddiwyd strwythur ectodomain SPACA6 a strwythurau unigol parthau tebyg i 4HB ac Ig i chwilio am gofnodion strwythurol debyg mewn cronfeydd data protein 42 .Fe wnaethom nodi paru gyda sgorau Dali Z uchel, gwyriadau safonol bach, a sgorau LALI mawr (yr olaf oedd nifer y gweddillion cyfatebol yn strwythurol).Er bod gan y 10 trawiad cyntaf o'r chwiliad ectodomain llawn (Tabl S1) sgôr Z derbyniol o >842, dangosodd chwiliad am barth tebyg i 4HB neu Ig yn unig fod y rhan fwyaf o'r trawiadau hyn yn cyfateb i β-brechdanau yn unig.plyg hollbresennol a geir mewn llawer o broteinau.Dim ond un canlyniad a gafwyd ym mhob un o'r tri chwiliad yn Dali: IZUMO1.
Awgrymwyd ers tro bod SPACA6 ac IZUMO1 yn rhannu tebygrwydd strwythurol7,32,37.Er mai dim ond 21% o hunaniaeth dilyniant y mae ectodomains y ddau brotein sy'n gysylltiedig ag ymasiad gamet yn ei rannu (Ffigur S8a), roedd tystiolaeth gymhleth, gan gynnwys patrwm bondiau disulfide wedi'i gadw a pharth tebyg i Ig terfynell-C a ragwelir yn SPACA6, yn caniatáu ymdrechion cynnar i adeiladu model homoleg o A llygoden SPACA6 gan ddefnyddio IZUMO1 fel templed37.Mae ein strwythur yn cadarnhau'r rhagfynegiadau hyn ac yn dangos y graddau gwirioneddol o debygrwydd.Mewn gwirionedd, mae strwythurau SPACA6 a IZUMO137,43,44 yn rhannu'r un pensaernïaeth dau barth (Ffig. S8b) gyda pharthau β-rhyngosod tebyg 4HB ac Ig-debyg wedi'u cysylltu gan ranbarth colfach (Ffig. S8c).
Mae gan IZUMO1 a SPACA6 4HB wahaniaethau cyffredin o fwndeli troellog confensiynol.Mae gan 4HBs nodweddiadol, fel y rhai a geir mewn cyfadeiladau protein SNARE sy'n ymwneud ag ymasiad endosomaidd 45,46, helisau wedi'u gwasgaru'n gyfartal gan gynnal crymedd cyson o amgylch echel ganolog 47. Mewn cyferbyniad, roedd y parthau helical yn IZUMO1 a SPACA6 yn ystumio, gyda chrymedd amrywiol a pacio anwastad (Ffigur S8d).Mae'r tro, a achosir yn ôl pob tebyg gan y triongl a ffurfiwyd gan helices 1′, 1 a 2, yn cael ei gadw yn IZUMO1 a SPACA6 a'i sefydlogi gan yr un motiff CXXC ar helics 1′.Fodd bynnag, mae'r bond disulfide ychwanegol a geir yn SPACA6 (Cys41 a Cys55 sy'n cysylltu helices 1 a 2 uchod yn gofalent) yn creu brig mwy miniog ar frig y triongl, gan wneud SPACA6 yn fwy troellog nag IZUMO1, gyda thrionglau ceudod mwy amlwg.Yn ogystal, nid oes gan IZUMO1 Arg37 a welwyd yng nghanol y ceudod hwn yn SPACA6.Mewn cyferbyniad, mae gan IZUMO1 graidd hydroffobig mwy nodweddiadol o weddillion aliffatig ac aromatig.
Mae gan IZUMO1 barth tebyg i Ig sy'n cynnwys β-dalen â dwy haen a phum-haen43.Mae'r llinyn ychwanegol yn IZUMO1 yn disodli'r coil yn SPACA6, sy'n rhyngweithio â'r llinyn F i gyfyngu ar fondiau hydrogen asgwrn cefn yn y llinyn.Pwynt cymharu diddorol yw'r wefr arwyneb a ragwelir ar gyfer parthau tebyg i Ig y ddau brotein.Mae wyneb IZUMO1 yn fwy negyddol nag arwyneb SPACA6.Mae tâl ychwanegol wedi'i leoli ger y terminws C sy'n wynebu'r bilen sberm.Yn SPACA6, roedd yr un rhanbarthau yn fwy niwtral neu â gwefr bositif (Ffig. S8e).Er enghraifft, mae'r arwyneb hydroffobig (ymylon teneuach) a'r pyllau â gwefr bositif (ymylon ehangach) yn SPACA6 wedi'u gwefru'n negyddol yn IZUMO1.
Er bod y berthynas a'r elfennau strwythur eilaidd rhwng IZUMO1 a SPACA6 wedi'u cadw'n dda, dangosodd aliniad strwythurol y parthau tebyg i Ig fod y ddau faes yn wahanol yn eu cyfeiriadedd cyffredinol o gymharu â'i gilydd ( Ffig. S9 ).Mae'r bwndel troellog o IZUMO1 yn grwm o amgylch y β-brechdan, gan greu'r siâp “boomerang” a ddisgrifiwyd yn flaenorol tua 50 ° o'r echelin ganolog.Mewn cyferbyniad, roedd y trawst helical yn SPACA6 wedi'i ogwyddo tua 10 ° i'r cyfeiriad arall.Mae'r gwahaniaethau yn y cyfeiriadedd hyn yn debygol oherwydd gwahaniaethau yn y rhanbarth colfach.Ar lefel y dilyniant cynradd, nid yw IZUMO1 a SPACA6 yn rhannu llawer o debygrwydd dilyniant yn y colfach, ac eithrio gweddillion cystein, glycin a asid aspartig.O ganlyniad, mae bondiau hydrogen a rhwydweithiau electrostatig yn hollol wahanol.Rhennir elfennau strwythur eilaidd β-dalen gan IZUMO1 a SPACA6, er bod y cadwyni yn IZUMO1 yn llawer hirach ac mae'r helix 310 (helix 5) yn unigryw i SPACA6.Mae'r gwahaniaethau hyn yn arwain at gyfeiriadedd parth gwahanol ar gyfer dau brotein sydd fel arall yn debyg.
Datgelodd ein chwiliad gweinydd Dali mai SPACA6 ac IZUMO1 yw'r unig ddau strwythur a bennir yn arbrofol ac sy'n cael eu storio yn y gronfa ddata protein sydd â'r plygiad 4HB penodol hwn (Tabl S1).Yn fwy diweddar, mae DeepMind (Wyddor/Google) wedi datblygu AlphaFold, system niwral seiliedig ar rwydwaith sy'n gallu rhagweld yn gywir strwythurau 3D proteinau o ddilyniannau cynradd48.Yn fuan ar ôl i ni ddatrys strwythur SPACA6, rhyddhawyd cronfa ddata AlphaFold, gan ddarparu modelau strwythur rhagfynegol yn cwmpasu 98.5% o'r holl broteinau yn y proteome dynol48,49.Gan ddefnyddio ein strwythur SPACA6 wedi’i ddatrys fel model chwilio, nododd chwiliad homoleg strwythurol ar gyfer y model yn y proteome dynol AlphaFold ymgeiswyr â thebygrwydd strwythurol posibl i SPACA6 ac IZUMO1.O ystyried cywirdeb anhygoel AlphaFold wrth ragfynegi SPACA6 (Ffig. S10a) - yn enwedig yr ectodomain 1.1 Å rms o'i gymharu â'n strwythur wedi'i ddatrys (Ffig. S10b) - gallwn fod yn hyderus bod y cyfatebiadau SPACA6 a nodwyd yn debygol o fod yn gywir.
Yn flaenorol, bu PSI-BLAST yn chwilio am glwstwr IZUMO1 gyda thri phrotein arall sy'n gysylltiedig â sberm: IZUMO2, IZUMO3, ac IZUMO450.Rhagwelodd AlphaFold fod y proteinau teulu IZUMO hyn yn plygu i mewn i'r parth 4HB gyda'r un patrwm bond disulfide ag IZUMO1 (Ffigurau 3a ac S11), er nad oes ganddynt barth tebyg i Ig.Rhagdybir bod IZUMO2 ac IZUMO3 yn broteinau pilen unochrog sy'n debyg i IZUMO1, tra bod IZUMO4 yn ymddangos fel pe bai'n cael ei gyfrinachu.Nid yw swyddogaethau proteinau IZUMO 2, 3, a 4 mewn ymasiad gamet wedi'u pennu.Mae'n hysbys bod IZUMO3 yn chwarae rhan mewn biogenesis acrosom yn ystod datblygiad sberm51 a chanfuwyd bod y protein IZUMO yn ffurfio cyfadeilad50.Mae cadwraeth proteinau IZUMO mewn mamaliaid, ymlusgiaid, ac amffibiaid yn awgrymu bod eu swyddogaeth bosibl yn gyson â phroteinau hysbys eraill sy'n gysylltiedig â gamet-fusion, megis DCST1/2, SOF1, a FIMP.
Diagram o bensaernïaeth parth yr uwch-deulu IST, gyda pharthau tebyg i 4HB, colfach, ac Ig wedi'u hamlygu mewn oren, gwyrdd a glas, yn y drefn honno.Mae gan IZUMO4 ranbarth C-terminal unigryw sy'n edrych yn ddu.Mae bondiau disulfide wedi'u cadarnhau a rhai tybiedig yn cael eu dangos gan linellau solet a dot, yn y drefn honno.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F95), a DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) yn cael eu harddangos yn yr un ystod lliw â phanel A. Dangosir bondiau disulfide mewn magenta.Ni ddangosir helices trawsbilen TMEM95, IZUMO2 ac IZUMO3.
Yn wahanol i'r protein IZUMO, credir bod proteinau SPACA eraill (hy, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, a SPACA9) yn strwythurol wahanol i SPACA6 (Ffig. S12).Dim ond SPACA9 sydd â 4HB, ond ni ddisgwylir iddo fod â'r un cyfeiriadedd cyfochrog-gwrth-gyfochrog na'r un bond disulfide â SPACA6.Dim ond SPACA1 sydd â pharth tebyg i Ig.Mae AlphaFold yn rhagweld bod gan SPACA3, SPACA4 a SPACA5 strwythur hollol wahanol i SPACA6.Yn ddiddorol, mae'n hysbys hefyd bod SPACA4 yn chwarae rhan mewn ffrwythloni, ond i raddau mwy na SPACA6, gan hwyluso'r rhyngweithio rhwng sberm ac oocyte zona pellucida52 yn lle hynny.
Daeth ein chwiliad AlphaFold o hyd i gyfateb arall ar gyfer IZUMO1 a SPACA6 4HB, TMEM95.Mae TMEM95, sef un protein trawsbilen sy'n benodol i sberm, yn gwneud llygod gwrywaidd yn anffrwythlon pan gânt eu abladu 32,33.Roedd gan sbermatozoa diffyg TMEM95 morffoleg arferol, symudedd, a'r gallu i dreiddio i'r zona pellucida a rhwymo i'r bilen wy, ond ni allai asio â'r bilen oocyte.Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod TMEM95 yn rhannu tebygrwydd strwythurol ag IZUMO133.Yn wir, cadarnhaodd model AlphaFold fod TMEM95 yn 4HB gyda'r un pâr o fotiffau CXXC â IZUMO1 a SPACA6 a'r un bond disulfide ychwanegol rhwng helices 1 a 2 a geir yn SPACA6 (Ffig. 3a a S11).Er nad oes gan TMEM95 barth tebyg i Ig, mae ganddo ranbarth â phatrwm bond disulfide tebyg i ranbarthau colfach SPACA6 ac IZUMO1 (Ffig. 3b).Ar adeg cyhoeddi'r llawysgrif hon, adroddodd y gweinydd rhagargraffu strwythur TMEM95, gan gadarnhau canlyniad AlphaFold53.Mae TMEM95 yn debyg iawn i SPACA6 ac IZUMO1 ac mae eisoes wedi'i gadw'n esblygiadol mewn amffibiaid (Ffig. 4 ac S13).
Defnyddiodd y chwiliad PSI-BLAST gronfeydd data NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, a SOF1 i bennu lleoliad y dilyniannau hyn yn y goeden fywyd.Nid yw'r pellteroedd rhwng pwyntiau cangen yn cael eu dangos i raddfa.
Mae'r tebygrwydd strwythurol cyffredinol trawiadol rhwng SPACA6 ac IZUMO1 yn awgrymu eu bod yn aelodau sefydlu o uwchdeulu strwythurol cadwraeth sy'n cynnwys y proteinau TMEM95 ac IZUMO 2, 3, a 4.aelodau hysbys: IZUMO1, SPACA6 a TMEM95.Gan mai dim ond ychydig o aelodau sy'n meddu ar barthau tebyg i Ig, nodwedd yr uwchdeulu IST yw'r parth 4HB, sydd â nodweddion unigryw sy'n gyffredin i'r holl broteinau hyn: 1) Wedi'i dorchi 4HB gyda helices wedi'u trefnu mewn newid gwrth-gyfochrog / cyfochrog (Ffig 5a), 2) mae gan y bwndel wyneb trionglog sy'n cynnwys dau helics o fewn y bwndel a thrydydd helics fertigol (Ffig. ardal allweddol (Ffig. 5c) Gwyddys bod y motiff CXXC, a geir mewn proteinau tebyg i thioredocsin, yn gweithredu fel synhwyrydd rhydocs 54,55,56 , tra gall y motiff mewn aelodau o'r teulu IST fod yn gysylltiedig ag isomerasau disulfide protein megis ERp57 mewn ymasiad gametau Mae rolau yn gysylltiedig 57,58.
Mae aelodau o'r uwchdeulu IST yn cael eu diffinio gan dair nodwedd nodweddiadol o barth 4HB: pedwar helices am yn ail rhwng cyfeiriadedd cyfochrog a gwrthbarel, wynebau bwndeli helical ba-trionglog, a motiff dwbl ca CXXC wedi'i ffurfio rhwng moleciwlau bach.) Helixau N-terminal (oren) a rhanbarth colfach β-hairpin (gwyrdd).
O ystyried y tebygrwydd rhwng SPACA6 ac IZUMO1, profwyd gallu'r cyntaf i rwymo i IZUMO1 neu JUNO.Mae interferometreg biolayer (BLI) yn ddull rhwymo cinetig a ddefnyddiwyd yn flaenorol i feintioli'r rhyngweithio rhwng IZUMO1 a JUNO.Ar ôl deori'r synhwyrydd wedi'i labelu â biotin gyda IZUMO1 fel abwyd gyda chrynodiad uchel o ddadansoddiad JUNO, canfuwyd signal cryf (Ffig. S14a), sy'n nodi newid a achosir gan rwymo yn nhrwch y biomaterial sydd ynghlwm wrth flaen y synhwyrydd.Arwyddion tebyg (hy, JUNO ynghyd â'r synhwyrydd fel abwyd yn erbyn analyte IZUMO1) (Ffig. S14b).Ni chanfuwyd unrhyw signal pan ddefnyddiwyd SPACA6 fel dadansoddwr yn erbyn IZUMO1 wedi'i rwymo â synhwyrydd neu JUNO wedi'i rwymo â synhwyrydd (Ffigur S14a,b).Mae absenoldeb y signal hwn yn dangos nad yw parth allgellog SPACA6 yn rhyngweithio â pharth allgellog IZUMO1 neu JUNO.
Oherwydd bod y assay BLI yn seiliedig ar fiotinylation o weddillion lysin rhad ac am ddim ar y protein abwyd, gall yr addasiad hwn atal rhwymo os yw gweddillion lysin yn rhan o'r rhyngweithio.Yn ogystal, gall cyfeiriadedd y rhwymiad o'i gymharu â'r synhwyrydd greu rhwystrau sterig, felly perfformiwyd profion tynnu i lawr confensiynol hefyd ar yr ectodomainau SPACA6, IZUMO1 a JUNO ailgyfunol.Er gwaethaf hyn, ni wnaeth SPACA6 waddodi gyda'i IZUMO1 wedi'i dagio na'i JUNO wedi'i dagio (Ffig. S14c,d), gan nodi nad oedd unrhyw ryngweithio yn gyson â'r hyn a welwyd mewn arbrofion BLI.Fel rheolaeth gadarnhaol, cadarnhawyd rhyngweithiad JUNO â'r label Ei IZUMO1 (Ffigurau S14e a S15).
Er gwaethaf y tebygrwydd strwythurol rhwng SPACA6 ac IZUMO1, nid yw anallu SPACA6 i rwymo JUNO yn syndod.Mae gan wyneb IZUMO1 dynol fwy nag 20 o weddillion sy'n rhyngweithio â JUNO, gan gynnwys gweddillion o bob un o'r tri rhanbarth (er bod y rhan fwyaf ohonynt wedi'u lleoli yn y rhanbarth colfach) (Ffig. S14f).O'r gweddillion hyn, dim ond un sy'n cael ei gadw yn SPACA6 (Glu70).Er bod llawer o amnewidion gweddillion wedi cadw eu priodweddau biocemegol gwreiddiol, disodlwyd y gweddillion Arg160 hanfodol yn IZUMO1 gan yr Asp148 â gwefr negyddol yn SPACA6;mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod y treiglad Arg160Glu yn IZUMO1 bron yn gyfan gwbl yn diddymu rhwymiad i JUNO43.Yn ogystal, cynyddodd y gwahaniaeth mewn cyfeiriadedd parth rhwng IZUMO1 a SPACA6 yn sylweddol arwynebedd arwyneb safle JUNO-rhwymo'r rhanbarth cyfatebol ar SPACA6 (Ffig. S14g).
Er gwaethaf yr angen hysbys am SPACA6 ar gyfer ymasiad gamet a'i debygrwydd i IZUMO1, nid yw'n ymddangos bod gan SPACA6 swyddogaeth rhwymo JUNO cyfatebol.Felly, rydym wedi ceisio cyfuno ein data strwythurol â thystiolaeth o bwysigrwydd a ddarperir gan fioleg esblygiadol.Mae aliniad dilyniant homologau SPACA6 yn dangos cadwraeth y strwythur cyffredin y tu hwnt i famaliaid.Er enghraifft, mae gweddillion cystein yn bresennol hyd yn oed mewn amffibiaid sy'n perthyn o bell (Ffig. 6a).Gan ddefnyddio'r gweinydd ConSurf, mapiwyd data cadw aliniad dilyniant lluosog o 66 o ddilyniannau i'r wyneb SPACA6.Gall y math hwn o ddadansoddiad ddangos pa weddillion sydd wedi'u cadw yn ystod esblygiad protein a gall ddangos pa ranbarthau arwyneb sy'n chwarae rhan mewn swyddogaeth.
a Aliniad dilyniant o ectodomain SPACA6 o 12 rhywogaeth wahanol wedi'u paratoi gan ddefnyddio CLUSTAL OMEGA.Yn ôl dadansoddiad ConSurf, mae'r safleoedd mwyaf ceidwadol wedi'u marcio mewn glas.Mae gweddillion cystein wedi'u hamlygu mewn coch.Dangosir ffiniau parth ac elfennau adeiledd eilaidd ar frig yr aliniad, lle mae saethau'n dynodi llinynnau β a thonnau'n dynodi helices.Dynodwyr Mynediad NCBI sy'n cynnwys y dilyniannau yw: dynol (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucopaeus, XP_011821277), mwnci capuchin (Cebus dynwared, XP_017359366), lladdwr ceffyl (Equus_02ca_123e), lladdwr ceffyl (Equus_1023e, XP025 neu Equus caballus), XP6 3 XP_032_034) .), defaid (Ovis aries, XP_014955560), eliffant (Loxodonta africana, XP_010585293), ci (Canis lupus familyis, XP_025277208), llygoden (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian diafol_0003: XPSarcop_03, Tasmanian diafol (XP603, XPSar) , 8) , 61_89 a Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Mae'r rhifo yn seiliedig ar drefn ddynol.b Cynrychiolaeth arwyneb strwythur SPACA6 gyda 4HB ar y brig a pharth tebyg i Ig ar y gwaelod, lliwiau yn seiliedig ar amcangyfrifon cadwraeth gan weinydd ConSurf.Mae'r rhannau sydd wedi'u cadw orau mewn glas, mae'r rhannau sydd wedi'u cadw'n gymedrol mewn gwyn, ac mae'r rhannau sydd wedi'u cadw leiaf mewn melyn.cystein porffor.Dangosir tri darn arwyneb sy'n dangos lefel uchel o amddiffyniad yn y clytiau mewnosod sydd wedi'u labelu 1, 2 a 3. Dangosir cartŵn 4HB yn y mewnosodiad ar y dde uchaf (yr un cynllun lliw).
Mae gan strwythur SPACA6 dri rhanbarth arwyneb sydd wedi'u cadw'n dda (Ffig. 6b).Mae Patch 1 yn rhychwantu 4HB a'r rhanbarth colfach ac yn cynnwys dwy bont disulfide CXXC wedi'u cadw, rhwydwaith colfach Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Ffig. S7), a thri gweddillion aromatig allanol wedi'u cadw (Phe31, Tyr73, Phe137)).ymyl ehangach o'r parth tebyg i Ig (Ffig. S6e), sy'n cynrychioli nifer o weddillion â gwefr bositif ar yr wyneb sberm.Yn ddiddorol, mae'r darn hwn yn cynnwys epitop gwrthgorff y dangoswyd yn flaenorol ei fod yn ymyrryd â swyddogaeth SPACA6 30.Mae rhanbarth 3 yn rhychwantu'r colfach ac un ochr i'r parth tebyg i Ig;mae'r rhanbarth hwn yn cynnwys prolines cadw (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) a gweddillion pegynol/wedi'u gwefru sy'n wynebu allan.Yn syndod, mae'r rhan fwyaf o'r gweddillion ar wyneb 4HB yn amrywiol iawn (Ffig. 6b), er bod y plyg yn cael ei gadw trwy gydol homolog SPACA6 (fel y nodir gan geidwadaeth craidd y bwndeli hydroffobig) a thu hwnt i'r superfamily IST.
Er mai dyma'r rhanbarth lleiaf yn SPACA6 gyda'r lleiaf o elfennau adeiledd eilaidd y gellir eu canfod, mae llawer o weddillion rhanbarth colfach (gan gynnwys rhanbarth 3) wedi'u cadw'n fawr ymhlith homologau SPACA6, a allai ddangos bod cyfeiriadedd y bwndel helical a'r brechdan β yn chwarae rhan.fel ceidwadwr.Fodd bynnag, er gwaethaf bondio hydrogen helaeth a rhwydweithiau electrostatig yn rhanbarth colfach SPACA6 ac IZUMO1, gellir gweld tystiolaeth o hyblygrwydd cynhenid ​​​​yn aliniad strwythurau lluosog a ganiateir IZUMO137,43,44.Roedd aliniad y parthau unigol yn gorgyffwrdd yn dda, ond roedd cyfeiriadedd y parthau o'i gymharu â'i gilydd yn amrywio o 50 ° i 70 ° o'r echel ganolog ( Ffig. S16 ).Er mwyn deall deinameg cydffurfiadol SPACA6 mewn hydoddiant, perfformiwyd arbrofion SAXS (Ffig. S17a,b).Roedd adluniad ab initio o'r ectodomain SPACA6 yn cydymffurfio â strwythur grisial gwialen (Ffig. S18), er bod llain Kratky yn dangos rhywfaint o hyblygrwydd (Ffig. S17b).Mae'r cydffurfiad hwn yn cyferbynnu ag IZUMO1, lle mae'r protein heb ei rwymo yn cymryd siâp bwmerang yn y dellt ac mewn hydoddiant43.
Er mwyn nodi'r rhanbarth hyblyg yn benodol, perfformiwyd sbectrosgopeg màs cyfnewid hydrogen-deuteriwm (H-DXMS) ar SPACA6 a'i gymharu â data a gafwyd yn flaenorol ar IZUMO143 (Ffig. 7a,b).Mae SPACA6 yn amlwg yn fwy hyblyg nag IZUMO1, fel y dangosir gan y cyfnewid deuteriwm uwch ledled y strwythur ar ôl 100,000 s o gyfnewid.Yn y ddau strwythur, mae rhan C-terminal y rhanbarth colfach yn dangos lefel uchel o gyfnewid, sydd yn ôl pob tebyg yn caniatáu cylchdroi cyfyngedig o barthau tebyg i 4HB ac Ig o gymharu â'i gilydd.Yn ddiddorol, mae rhan terfynell C colfach SPACA6, sy'n cynnwys gweddillion 147CDLPLDCP154, yn rhanbarth 3 sydd wedi'i gadw'n fawr (Ffig. 6b), sy'n awgrymu o bosibl bod hyblygrwydd rhwng parthau yn nodwedd a warchodir yn esblygiadol o SPACA6.Yn ôl y dadansoddiad hyblygrwydd, dangosodd data toddi thermol CD fod SPACA6 (Tm = 51.2°C) yn llai sefydlog nag IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (Ffig. S1e ac S19).
a delweddau H-DXMS o SPACA6 a b IZUMO1.Pennwyd canran y cyfnewid dewteriwm ar y pwyntiau amser a nodwyd.Dangosir lefelau cyfnewid hydrogen-deuteriwm yn ôl lliw ar raddfa graddiant o las (10%) i goch (90%).Mae blychau du yn cynrychioli ardaloedd o gyfnewid uchel.Dangosir ffiniau parth tebyg i 4HB, colfach a Ig a welir yn y strwythur grisial uwchben y dilyniant cynradd.Cafodd lefelau cyfnewid Deuterium ar 10 s, 1000 s, a 100,000 s eu plotio ar siart stribedi wedi'i arosod ar arwynebau moleciwlaidd tryloyw SPACA6 ac IZUMO1.Mae rhannau o strwythurau sydd â lefel cyfnewid dewteriwm o dan 50% wedi'u lliwio'n wyn.Mae ardaloedd uwchlaw 50% cyfnewid H-DXMS wedi'u lliwio mewn graddfa graddiant.
Mae'r defnydd o CRISPR/Cas9 a strategaethau genetig cnocio genynnau llygoden wedi arwain at nodi nifer o ffactorau sy'n bwysig ar gyfer rhwymo sberm ac wyau ac ymasiad.Ar wahân i ryngweithio nodwedd dda o strwythur IZUMO1-JUNO a CD9, mae'r rhan fwyaf o'r proteinau sy'n gysylltiedig ag ymasiad gamet yn parhau i fod yn enigmatig yn strwythurol ac yn swyddogaethol.Mae nodweddu bioffisegol a strwythurol SPACA6 yn ddarn arall o'r pos moleciwlaidd adlyniad/fusion yn ystod ffrwythloniad.
Mae'n ymddangos bod SPACA6 ac aelodau eraill o'r uwchdeulu IST wedi'u gwarchod yn fawr mewn mamaliaid yn ogystal ag adar unigol, ymlusgiaid ac amffibiaid;mewn gwirionedd, credir bod angen SPACA6 hyd yn oed ar gyfer ffrwythloni pysgod sebra 59. Mae'r dosbarthiad hwn yn debyg i broteinau hysbys eraill sy'n gysylltiedig â ymasiad gamet fel DCST134, DCST234, FIMP31, a SOF132, sy'n awgrymu bod y ffactorau hyn yn ddiffygiol o ran HAP2 (hefyd a elwir yn GCS1) proteinau sy'n gyfrifol am weithgaredd catalytig llawer o brotyddion., planhigion, ac arthropodau.Proteinau ymasiad wedi'i ffrwythloni 60, 61. Er gwaethaf y tebygrwydd adeileddol cryf rhwng SPACA6 ac IZUMO1, arweiniodd sgil-effeithiau amgodio'r naill neu'r llall o'r proteinau hyn at anffrwythlondeb mewn llygod gwrywaidd, sy'n dangos nad yw eu swyddogaethau mewn ymasiad gametau yn cael eu dyblygu..Yn fwy cyffredinol, nid oes unrhyw un o'r proteinau sberm hysbys sydd eu hangen ar gyfer y cyfnod adlyniad o ymasiad yn segur.
Mae'n parhau i fod yn gwestiwn agored a yw SPACA6 (ac aelodau eraill o'r uwch-deulu IST) yn cymryd rhan mewn cyffyrdd rhynggamatig, yn ffurfio rhwydweithiau intragametig i recriwtio proteinau pwysig i bwyntiau ymasiad, neu efallai hyd yn oed yn gweithredu fel ffwsogenau swil.Datgelodd astudiaethau cyd-imiwneddiad mewn celloedd HEK293T ryngweithio rhwng IZUMO1 hyd llawn a SPACA632.Fodd bynnag, nid oedd ein ectodomains ailgyfunol yn rhyngweithio in vitro, sy'n awgrymu bod y rhyngweithiadau a welwyd yn Noda et al.cafodd y ddau eu dileu yn y lluniad (sylwch ar gynffon cytoplasmig IZUMO1, y dangoswyd ei bod yn ddiangen ar gyfer ffrwythloni62).Fel arall, efallai y bydd IZUMO1 a/neu SPACA6 angen amgylcheddau rhwymol penodol nad ydym yn eu hatgynhyrchu in vitro, megis cydffurfiadau ffisiolegol benodol neu gyfadeiladau moleciwlaidd sy'n cynnwys proteinau eraill (hysbys neu heb eu darganfod eto).Er y credir bod ectodomain IZUMO1 yn cyfryngu ymlyniad sbermatosoa i'r wy yn y gofod perivitelline, nid yw pwrpas yr ectodomain SPACA6 yn glir.
Mae adeiledd SPACA6 yn datgelu sawl arwyneb cadw a all fod yn gysylltiedig â rhyngweithiadau protein-protein.Mae gan y rhan warchodedig o'r rhanbarth colfach sy'n union gerllaw'r motiff CXXC (a ddynodwyd Patch 1 uchod) nifer o weddillion aromatig sy'n wynebu tuag allan sy'n aml yn gysylltiedig â rhyngweithiadau hydroffobig a π-pentyrru rhwng biomoleciwlau.Mae ochrau eang y parth tebyg i Ig (rhanbarth 2) yn ffurfio rhigol wedi'i wefru'n bositif gydag Arg a'i weddillion Ef sydd wedi'u cadw'n fawr, ac mae gwrthgyrff yn erbyn y rhanbarth hwn wedi'u defnyddio o'r blaen i rwystro ymasiad gamet 30 .Mae'r gwrthgorff yn cydnabod yr epitope llinellol 212RIRPAQLTHRGTFS225, sydd â thri o'r chwe gweddillion arginin a His220 sydd wedi'i gadw'n fawr.Nid yw'n glir a yw'r camweithrediad oherwydd rhwystr yn y gweddillion penodol hyn neu'r rhanbarth cyfan.Mae lleoliad y bwlch hwn ger terminws C y β-brechdan yn nodi rhyngweithiadau cis â phroteinau sberm cyfagos, ond nid â phroteinau oocyt.Ymhellach, gallai cadw tangle hynod hyblyg-proline-gyfoethog (safle 3) o fewn y colfach fod yn safle rhyngweithiad protein-protein neu, yn fwy tebygol, yn arwydd o gadw hyblygrwydd rhwng y ddau barth.Mae rhyw yn bwysig ar gyfer rôl anhysbys SPACA6.cyfuniad o gametau.
Mae gan SPACA6 briodweddau proteinau adlyniad rhynggellog, gan gynnwys brechdanau β tebyg i Ig.Mae llawer o broteinau gludiog (ee, cadherinau, integrinau, adhesins, ac IZUMO1) yn meddu ar un neu fwy o barthau β-rhyngosod sy'n ymestyn proteinau o'r gellbilen i'w targedau amgylcheddol63,64,65.Mae parth tebyg i Ig yn SPACA6 hefyd yn cynnwys motiff a geir yn gyffredin mewn β-brechdanau o adlyniad a chydlyniad: dwbledau o linynnau cyfochrog ar bennau β-brechdanau, a elwir yn glampiau mecanyddol66.Credir bod y motiff hwn yn cynyddu ymwrthedd i rymoedd cneifio, sy'n werthfawr ar gyfer proteinau sy'n ymwneud â rhyngweithiadau rhynggellog.Fodd bynnag, er gwaethaf y tebygrwydd hwn i adhesins, nid oes tystiolaeth ar hyn o bryd bod SPACA6 yn rhyngweithio â gwynwy.Nid yw'r ectodomain SPACA6 yn gallu rhwymo i JUNO, a phrin y mae celloedd HEK293T sy'n mynegi SPACA6, fel y dangosir yma, yn rhyngweithio ag oocytau heb zona 32 .Os yw SPACA6 yn sefydlu bondiau rhynggamatig, efallai y bydd angen addasiadau ôl-gyfieithu ar y rhyngweithiadau hyn neu gael eu sefydlogi gan broteinau sberm eraill.I gefnogi'r ddamcaniaeth olaf, mae sbermatosoa diffygiol IZUMO1 yn rhwymo i oocytau, gan ddangos bod moleciwlau heblaw IZUMO1 yn cymryd rhan yn y cam adlyniad gamet 27 .
Mae gan lawer o broteinau ymasiad firaol, cellog a datblygiadol briodweddau sy'n rhagweld eu swyddogaeth fel ffiwsogenau.Er enghraifft, mae gan glycoproteinau ymasiad firaol (dosbarthiadau I, II a III) peptid neu ddolen ymasiad hydroffobig ar ddiwedd y protein sy'n cael ei fewnosod yn y bilen lletyol.Ni ddangosodd map hydrophilicity IZUMO143 a strwythur (penderfynedig a rhagfynegedig) yr uwchdeulu IST unrhyw peptid ymasiad hydroffobig ymddangosiadol.Felly, os oes unrhyw broteinau yn yr uwchdeulu IST yn gweithredu fel ffiwsogenau, maent yn gwneud hynny mewn ffordd wahanol i enghreifftiau hysbys eraill.
I gloi, mae swyddogaethau aelodau uwch-deulu IST o broteinau sy'n gysylltiedig ag ymasiad gamete yn parhau i fod yn ddirgelwch syfrdanol.Bydd ein moleciwl ailgyfunol nodweddiadol SPACA6 a'i strwythur wedi'i ddatrys yn rhoi cipolwg ar y berthynas rhwng y strwythurau hyn a rennir a'u rôl mewn atodiad gametau ac ymasiad.
Cafodd y dilyniant DNA sy'n cyfateb i'r ectodomain SPACA6 dynol a ragwelir (rhif derbyn NCBI NP_001303901.1; gweddillion 27-246) ei optimeiddio codon ar gyfer mynegiant mewn celloedd Drosophila melanogaster S2 a'i syntheseiddio fel darn genyn gyda'r dilyniant amgodio Kozak (Eurofins Genomeg)., mae'r signal secretion BiP a'r 5′ a 3′ cyfatebol yn dod i ben ar gyfer clonio'r genyn hwn sy'n annibynnol ar ligation i fector mynegiant pMT yn seiliedig ar hyrwyddwr metallothionein a addaswyd i'w ddewis gyda puromycin (pMT-puro).Mae'r fector pMT-puro yn amgodio safle holltiad thrombin ac yna tag terfynell C 10x-E (Ffigur S2).
Perfformiwyd trawsnewidiad sefydlog fector pMT-puro SPACA6 i gelloedd D. melanogaster S2 (Gibco) yn debyg i'r protocol a ddefnyddir ar gyfer IZUMO1 a JUNO43.Cafodd celloedd S2 eu dadmer a'u tyfu yng nghyfrwng Schneider (Gibco) wedi'i ategu â chrynodiad terfynol o 10% (v/v) serwm llo ffetws anweithredol (Gibco) a gwrthfiotig gwrthmycotig 1X (Gibco).Roedd celloedd llwybr cynnar (3.0 x 106 cell) wedi'u platio mewn ffynhonnau unigol o blatiau 6-ffynnon (Corning).Ar ôl 24 awr o ddeori ar 27 ° C, trawslwythwyd celloedd â chymysgedd o 2 mg o fector pMT-puro SPACA6 ac adweithydd trawslif Effectene (Qiagen) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr.Deorwyd celloedd wedi'u trawsblannu am 72 awr ac yna eu cynaeafu â 6 mg/ml puromycin.Yna cafodd celloedd eu hynysu o gyfrwng Schneider's cyflawn a'u gosod mewn cyfrwng Pryfed-XPRESS (Lonza) heb serwm ar gyfer cynhyrchu protein ar raddfa fawr.Tyfwyd swp 1 L o ddiwylliant celloedd S2 i gelloedd 8-10 × 106 ml-1 mewn fflasg polypropylen Erlenmeyer polypropylen gwaelod fflat wedi'i awyru 2 L ac yna ei sterileiddio gyda chrynodiad terfynol o 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) a di-haint wedi'i hidlo.cymell.Deorwyd y diwylliannau anwythol ar 27 ° C. ar 120 rpm am bedwar diwrnod.
Cafodd cyfrwng wedi'i gyflyru sy'n cynnwys SPACA6 ei ynysu gan allgyrchiad ar 5660 × g ar 4 ° C ac yna system hidlo llif tangential Centramate (Pall Corp) gyda philen MWCO 10 kDa.Rhowch gyfrwng crynodedig sy'n cynnwys SPACA6 i golofn resin agarose Ni-NTA (Qiagen) 2 ml.Golchwyd y resin Ni-NTA gyda 10 cyfrol colofn (CV) o glustog A ac yna ychwanegwyd 1 CV o glustog A i roi crynodiad imidazole terfynol o 50 mM.Cafodd SPACA6 ei guddio gyda 10 ml o glustog A wedi'i ategu gan imidazole i grynodiad terfynol o 500 mM.Ychwanegwyd thrombin dosbarth cyfyngu (Millipore Sigma) yn uniongyrchol at y tiwbiau dialysis (MWCO 12-14 kDa) ar 1 uned fesul mg SPACA6 vs 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 a 150 mM NaCl (byffer B) ar gyfer dialysis.) ar 4°C am 48 awr.Yna cafodd y SPACA6 wedi'i hollti â thrombin ei wanhau'n driphlyg i leihau'r crynodiad o halen a'i lwytho ar golofn cyfnewid catation 1 ml MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE) wedi'i equilibredu â 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.Golchwyd y cyfnewidydd catïo â 3 CV o 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, yna cafodd SPACA6 ei osgoi gyda graddiant llinol o 0 i 500 mM NaCl mewn 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 am 25 CV.Ar ôl cromatograffaeth cyfnewid ïon, roedd SPACA6 wedi'i grynhoi i 1 ml a'i elwtio'n isocrataidd o golofn ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) wedi'i gydbwyso â byffer B. Yn ôl y cromatogram, ffracsiynau pwll a chrynodiad sy'n cynnwys SPACA6.Rheolwyd purdeb gan electrofforesis lliw Coomassie ar gel 16% SDS-polyacrylamid.Cafodd crynodiad protein ei feintioli trwy amsugnedd ar 280 nm gan ddefnyddio cyfraith Beer-Lambert a'r cyfernod difodiant molar damcaniaethol.
Cafodd SPACA6 wedi'i buro ei ddeialu dros nos yn erbyn sodiwm ffosffad 10 mM, pH 7.4 a 150 mM NaF a'i wanhau i 0.16 mg/mL cyn ei ddadansoddi gan sbectrosgopeg CD.Casglwyd sganio sbectrol o gryno ddisgiau gyda thonfedd o 185 i 260 nm ar sbectropolarimeter Jasco J-1500 gan ddefnyddio cuvettes cwarts gyda hyd llwybr optegol 1 mm (Helma) ar 25 ° C ar gyfradd o 50 nm/min.Cywirwyd y sbectra CD ar y llinell sylfaen, cyfartaledd o dros 10 caffaeliad, a throswyd i eliptigedd gweddilliol cymedrig (θMRE) mewn graddau cm2/dmol:
lle MW yw pwysau moleciwlaidd pob sampl yn Da;N yw nifer yr asidau amino;θ yw'r eliptigedd mewn miliraddau;d yn cyfateb i hyd y llwybr optegol mewn cm;crynodiad protein mewn unedau.