304 Tiwb torchog wedi'i weldio â dur di-staen / zomponent zhemical wedi'i weldio, Potensial Biosynthetig y Microbiome Morol Byd-eang

Diolch am ymweld â Nature.com.Rydych chi'n defnyddio fersiwn porwr gyda chefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn ogystal, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, rydym yn dangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Sliders yn dangos tair erthygl fesul sleid.Defnyddiwch y botymau cefn a nesaf i symud trwy'r sleidiau, neu'r botymau rheolydd sleidiau ar y diwedd i symud trwy bob sleid.

Disgrifiad manwl o'r cynnyrch

304 Tiwb/tiwb torchog dur gwrthstaen wedi'i weldio
1. Manyleb: Tiwb/tiwbiau coil dur di-staen
2. Math: weldio neu ddi-dor
3. Safon: ASTM A269, ASTM A249
4. tiwb coil dur di-staen OD: 6mm i 25.4MM
5. Hyd: 600-3500MM neu yn unol â gofyniad y cwsmer.
6. Trwch wal: 0.2mm i 2.0mm.

7. Goddefgarwch: OD: +/-0.01mm;Trwch: +/-0.01%.

8. Maint twll mewnol coil: 500MM-1500MM (gellir ei addasu yn unol â gofynion y cwsmer)

9. Coil uchder: 200MM-400MM (gellir ei addasu yn unol â gofynion cwsmeriaid)

10. Arwyneb: Bright neu annealed
11. Deunydd: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, aloi 625, 825, 2205, 2507, ac ati.
12. Pacio: bagiau gwehyddu mewn cas pren, paled pren, siafft pren, neu yn unol â gofyniad y cwsmer
13. Prawf: elfen gemegol, cryfder cynnyrch, cryfder tynnol, mesur caledwch
14. Gwarant: Arolygiad trydydd parti (er enghraifft: SGS TV), ac ati.
15. Cais: Addurno, dodrefn, cludo olew, cyfnewidydd gwres, gwneud rheiliau, gwneud papur, automobile, prosesu bwyd, meddygol, ac ati.

Mae cymunedau microbaidd naturiol yn amrywiol o ran ffylogenetig a metabolaidd.Yn ogystal â grwpiau o organebau nad ydynt yn cael eu hastudio1, mae gan yr amrywiaeth hwn hefyd botensial cyfoethog ar gyfer darganfod ensymau a chyfansoddion biocemegol o arwyddocâd ecolegol a biotechnolegol2,3.Fodd bynnag, mae astudio'r amrywiaeth hon i bennu'r llwybrau genomig sy'n syntheseiddio cyfansoddion o'r fath a'u clymu i'w priod westeion yn parhau i fod yn her.Mae potensial biosynthetig micro-organebau yn y cefnfor agored yn parhau i fod yn anhysbys i raddau helaeth oherwydd cyfyngiadau wrth ddadansoddi data cydraniad genom cyfan ar raddfa fyd-eang.Yma, rydym yn archwilio amrywiaeth ac amrywiaeth clystyrau genynnau biosynthetig yn y cefnfor trwy integreiddio tua 10,000 o genomau microbaidd o gelloedd diwylliedig a chelloedd sengl â mwy na 25,000 o genomau drafft newydd eu hail-greu o dros 1,000 o samplau dŵr môr.Mae'r ymdrechion hyn wedi nodi tua 40,000 o glystyrau genynnau biosynthetig tybiedig yn bennaf, y mae rhai ohonynt wedi'u canfod mewn grwpiau ffylogenetig nas amheuir yn flaenorol.Yn y poblogaethau hyn, fe wnaethom nodi llinach wedi'i gyfoethogi mewn clystyrau genynnau biosynthetig (“Candidatus Eudormicrobiaceae”) a oedd yn perthyn i ffylwm bacteriol heb ei drin ac a oedd yn cynnwys rhai o'r micro-organebau biosynthetig mwyaf amrywiol yn yr amgylchedd hwn.O'r rhain, rydym wedi nodweddu'r llwybrau ffosffatase-peptid a pytonamid, gan nodi achosion o strwythur cyfansawdd bioactif anarferol ac ensymoleg, yn y drefn honno.I gloi, mae'r astudiaeth hon yn dangos sut y gall strategaethau sy'n seiliedig ar ficrobiomau alluogi archwilio ensymau a bwydydd naturiol nas disgrifiwyd yn flaenorol mewn microbiota ac amgylchedd nad yw'n cael ei ddeall yn iawn.
Mae microbau yn gyrru cylchoedd biogeocemegol byd-eang, yn cynnal gweoedd bwyd, ac yn cadw planhigion ac anifeiliaid yn iach5.Mae eu hamrywiaeth ffylogenetig, metabolig a swyddogaethol enfawr yn cynrychioli potensial cyfoethog ar gyfer darganfod tacsa1, ensymau a chyfansoddion biocemegol newydd, gan gynnwys cynhyrchion naturiol6.Mewn cymunedau ecolegol, mae'r moleciwlau hyn yn darparu amrywiaeth o swyddogaethau ffisiolegol ac ecolegol i ficro-organebau, o gyfathrebu i gystadleuaeth 2, 7 .Yn ogystal â'u swyddogaethau gwreiddiol, mae'r cynhyrchion naturiol hyn a'u llwybrau cynhyrchu â chodau genetig yn darparu enghreifftiau ar gyfer cymwysiadau biotechnolegol a therapiwtig2,3.Mae'r gwaith o nodi llwybrau a chysylltiadau o'r fath wedi'i hwyluso'n fawr drwy astudio microbau diwylliedig.Fodd bynnag, mae astudiaethau tacsonomig o amgylcheddau naturiol wedi dangos nad yw mwyafrif helaeth y micro-organebau wedi cael eu tyfu8.Mae'r duedd ddiwylliannol hon yn cyfyngu ar ein gallu i fanteisio ar yr amrywiaeth swyddogaethol a amgodiwyd gan lawer o ficrobau4,9.
Er mwyn goresgyn y cyfyngiadau hyn, mae datblygiadau technolegol dros y degawd diwethaf wedi galluogi ymchwilwyr i ddilyniannu darnau DNA microbaidd yn uniongyrchol (hy, heb ddiwylliant blaenorol) o gymunedau cyfan (metagenomeg) neu gelloedd sengl.Mae'r gallu i gydosod y darnau hyn yn ddarnau genom mwy ac ail-greu genomau lluosog wedi'u cydosod yn fetagenomaidd (MAGs) neu genomau chwyddedig sengl (SAGs), yn y drefn honno, yn agor cyfle pwysig ar gyfer astudiaethau tacsentrig o'r microbiome (hy, cymunedau microbaidd a'r microbiome).palmantu llwybrau newydd.berchen ar ddeunydd genetig mewn amgylchedd penodol) 10,11,12.Yn wir, mae astudiaethau diweddar wedi ehangu'n fawr y gynrychiolaeth ffylogenetig o amrywiaeth microbaidd ar y Ddaear1, 13 ac wedi datgelu llawer o'r amrywiaeth swyddogaethol mewn cymunedau microbaidd unigol nad oedd wedi'u cynnwys o'r blaen gan ddilyniannau genom cyfeirio micro-organeb ddiwylliedig (REFs)14.Mae'r gallu i osod amrywiaeth swyddogaethol heb ei ddarganfod yng nghyd-destun y genom gwesteiwr (hy cydraniad genom) yn hanfodol ar gyfer rhagweld llinellau microbaidd annodweddiadol sydd yn ôl pob tebyg yn amgodio cynhyrchion naturiol newydd15,16 neu ar gyfer olrhain cyfansoddion o'r fath yn ôl i'w cynhyrchydd gwreiddiol17.Er enghraifft, mae dull dadansoddi genomig metagenomig ac un-gell cyfun wedi arwain at nodi Candidatus Entotheonella, grŵp o facteria sy'n gysylltiedig â sbwng sy'n gyfoethog yn fetabol, fel cynhyrchwyr amrywiaeth o botensial cyffuriau18.Fodd bynnag, er gwaethaf ymdrechion diweddar i archwilio genomig cymunedau microbaidd amrywiol,16,19 mae mwy na dwy ran o dair o'r data metagenomig byd-eang ar gyfer cefnfor mwyaf y Ddaear o ecosystemau16,20 yn dal ar goll.Felly, yn gyffredinol, mae potensial biosynthetig y microbiome morol a'i botensial fel ystorfa o gynhyrchion ensymatig a naturiol newydd yn parhau i fod heb eu hastudio i raddau helaeth.
Er mwyn archwilio potensial biosynthetig microbiomau morol ar raddfa fyd-eang, yn gyntaf fe wnaethom gyfuno genomau microbaidd morol a gafwyd gan ddefnyddio dulliau di-ddiwylliant a di-ddiwylliant i greu cronfa ddata helaeth o ffylogenetig a swyddogaeth genynnau.Datgelodd archwiliad o'r gronfa ddata hon amrywiaeth eang o glystyrau genynnau biosynthetig (BGCs), y rhan fwyaf ohonynt yn perthyn i deuluoedd clwstwr genynnau nad ydynt yn nodweddu (GCF) hyd yma.Yn ogystal, fe wnaethom nodi teulu bacteriol anhysbys sy'n arddangos yr amrywiaeth fwyaf hysbys o BGCs yn y cefnfor agored hyd yn hyn.Dewisasom ddau lwybr synthesis ribosomaidd a pheptid wedi'i addasu'n ôl-gyfieithol (RiPP) i'w dilysu'n arbrofol yn seiliedig ar eu gwahaniaethau genetig o'r llwybrau hysbys ar hyn o bryd.Mae nodweddiad swyddogaethol y llwybrau hyn wedi datgelu enghreifftiau annisgwyl o enzymoleg yn ogystal â chyfansoddion anarferol o strwythurol gyda gweithgaredd ataliol proteas.
I ddechrau, ein nod oedd creu adnodd data byd-eang ar gyfer dadansoddi genomau, gan ganolbwyntio ar ei gydrannau bacteriol ac archaeol.I’r perwyl hwn, fe wnaethom gyfuno data metagenomig a 1038 o samplau dŵr môr o 215 o safleoedd samplu a ddosbarthwyd yn fyd-eang (ystod lledred = 141.6°) a sawl haen ddwfn (o ddyfnder o 1 i 5600 m, gan gwmpasu’r parthau enigaidd, mesopelagig ac affwysol).Cefndir21,22,23 (Ffig. 1a, data estynedig, Ffig. 1a a Thabl Atodol 1).Yn ogystal â darparu cwmpas daearyddol eang, roedd y samplau hyn a hidlwyd yn ddetholus yn ein galluogi i gymharu gwahanol gydrannau'r microbiom morol, gan gynnwys llawn firws (<0.2 µm), cyfoethog procaryotig (0.2–3 µm), llawn gronynnau (0.8 µm). ).–20 µm) a chytrefi wedi'u disbyddu gan firws (>0.2 µm).
a, Casglwyd cyfanswm o 1038 o genomau (metagenomeg) sydd ar gael yn gyhoeddus o gymunedau microbaidd morol o 215 o leoliadau a ddosbarthwyd yn fyd-eang (62°S i 79°N a 179°W i 179°E.).Teils map © Esri.Ffynonellau: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ, ac Esri.b, defnyddiwyd y metagenomau hyn i ail-greu MAGs (dulliau a gwybodaeth ychwanegol), sy'n amrywio o ran maint ac ansawdd (dulliau) yn y setiau data (wedi'u marcio mewn lliw).Ategwyd y MAGs a ail-grewyd gan genomau (allanol) a oedd ar gael i'r cyhoedd, gan gynnwys MAG26, SAG27 a REF wedi'u gwneud â llaw.27 Llunio OMD.c, o'i gymharu ag adroddiadau blaenorol sy'n seiliedig ar SAG (GORG)20 neu MAG (GEM)16 yn unig, mae OMD yn gwella nodweddion genomig cymunedau microbaidd morol (cyfradd mapio darllen metagenomig; dull) ddwy neu dair gwaith gyda chynrychiolaeth fwy cyson mewn dyfnder a lledred..<0.2, n=151, 0.2-0.8, n=67, 0.2-3, n=180, 0.8-20, n=30, >0.2, n=610, <30°, n = 132, 30–60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, grwpio OMD i lefel clystyrau rhywogaethau (95% hunaniaeth niwcleotid cymedrig) yn nodi cyfanswm o tua 8300 o rywogaethau, gyda mwy na hanner ohonynt heb eu nodweddu o’r blaen yn ôl anodiadau tacsonomig gan ddefnyddio’r GTDB (fersiwn 89) e, dangosodd dosbarthiad rhywogaethau yn ôl math o genom fod MAG, SAG a REFs yn ategu ei gilydd yn dda wrth adlewyrchu amrywiaeth ffylogenetig y microbiome morol.Yn benodol, roedd 55%, 26% ac 11% o'r rhywogaethau yn benodol ar gyfer MAG, SAG a REF, yn y drefn honno.BATS, Cyfres Amser Iwerydd Bermuda;GEM, genomau microbiom y Ddaear;GORG, genom cyfeirio cefnfor byd-eang;HOT, cyfres amser Cefnfor Hawaii.
Gan ddefnyddio'r set ddata hon, fe wnaethom ail-greu cyfanswm o 26,293 MAGs, yn bennaf bacteriol ac archaeal (Ffig. 1b a data estynedig, Ffig. 1b).Fe wnaethon ni greu'r MAGs hyn o gynulliadau o samplau metagenomig ar wahân yn hytrach na rhai cyfun i atal amrywiadau dilyniant naturiol rhwng samplau o wahanol leoliadau neu bwyntiau amser (dulliau) rhag cwympo.Yn ogystal, fe wnaethom grwpio darnau genomig yn seiliedig ar eu cydberthyniadau mynychder ar draws nifer fawr o samplau (o 58 i 610 o samplau, yn dibynnu ar arolwg; dull).Canfuom fod hwn yn gam hir ond pwysig24 a hepgorwyd mewn sawl gwaith ailadeiladu MAG16, 19, 25 ar raddfa fawr ac sy’n gwella’n sylweddol faint (2.7 gwaith yn fwy ar gyfartaledd) ac ansawdd (+20% ar gyfartaledd) y genom.wedi'i ail-greu o'r metagenom morol a astudiwyd yma (data estynedig, Ffig. 2a a gwybodaeth ychwanegol).Yn gyffredinol, arweiniodd yr ymdrechion hyn at gynnydd o 4.5 gwaith mewn MAGs microbaidd morol (6 gwaith os mai dim ond MAGs o ansawdd uchel sy’n cael eu hystyried) o gymharu â’r adnodd MAG mwyaf cynhwysfawr sydd ar gael heddiw16 (Dulliau).Yna cyfunwyd y set MAG newydd hon â 830 o MAG26s a ddewiswyd â llaw, 5969 SAG27s a 1707 REF.Roedd saith ar hugain o rywogaethau o facteria morol ac archaea yn cynnwys casgliad cyfunol o 34,799 o genomau (Ffig. 1b).
Yna fe wnaethom werthuso’r adnodd newydd ei greu i wella ei allu i gynrychioli cymunedau microbaidd morol ac asesu effaith integreiddio gwahanol fathau o genomau.Ar gyfartaledd, canfuom ei fod yn cwmpasu tua 40-60% o ddata metagenomig morol (Ffigur 1c), dwy neu dair gwaith cwmpas adroddiadau MAG yn unig blaenorol mewn dyfnder a lledred Mwy cyfresol 16 neu SAG20.Yn ogystal, er mwyn mesur amrywiaeth tacsonomig mewn casgliadau sefydledig yn systematig, fe wnaethom anodi pob genom gan ddefnyddio pecyn cymorth (dulliau) Cronfa Ddata Tacsonomeg Genom (GTDB) a defnyddio hunaniaeth niwcleotid genom-eang gyfartalog o 95%.28 i nodi 8,304 o glystyrau o rywogaethau (rhywogaethau).Nid oedd dwy ran o dair o'r rhywogaethau hyn (gan gynnwys cladau newydd) wedi ymddangos yn y GTDB o'r blaen, a darganfuwyd 2790 ohonynt gan ddefnyddio'r MAG a ail-grewyd yn yr astudiaeth hon (Ffig. 1d).Yn ogystal, canfuom fod gwahanol fathau o genomau yn gyflenwol iawn: mae 55%, 26%, ac 11% o rywogaethau wedi'u cyfansoddi'n gyfan gwbl o MAG, SAG, a REF, yn y drefn honno (Ffig. 1e).Yn ogystal, roedd MAG yn cwmpasu pob un o'r 49 math a geir yn y golofn ddŵr, tra bod SAG a REF ond yn cynrychioli 18 ac 11 ohonynt, yn y drefn honno.Fodd bynnag, mae SAG yn cynrychioli amrywiaeth y cladau mwyaf cyffredin yn well (data estynedig, Ffig. 3a), megis Pelagic Bacteriales (SAR11), gyda SAG yn cwmpasu bron i 1300 o rywogaethau a MAG dim ond 390 o rywogaethau.Yn nodedig, anaml yr oedd REFs yn gorgyffwrdd â MAGs neu SAGs ar lefel y rhywogaeth ac yn cynrychioli >95% o’r tua 1000 o genomau nas canfuwyd yn setiau metagenomig y cefnfor agored a astudiwyd yma, yn bennaf oherwydd rhyngweithiadau â mathau eraill o sbesimenau morol cynrychioliadol ynysig (e.e. gwaddodion) .neu gwesteiwr-gydymaith).Er mwyn sicrhau ei fod ar gael yn eang i'r gymuned wyddonol, gellir cymharu'r adnodd genom morol hwn, sydd hefyd yn cynnwys darnau annosbarthedig (ee, o ffagau a ragwelir, ynysoedd genomig, a darnau genom lle nad oes digon o ddata ar gyfer ail-greu MAG), â data tacsonomig. .Anodiadau mynediad ynghyd â swyddogaeth genynnau a pharamedrau cyd-destunol yng Nghronfa Ddata Microbioleg y Cefnfor (OMD; https://microbiomics.io/ocean/).
Yna aethom ati i archwilio cyfoeth a newydd-deb potensial biosynthetig mewn microbiomau cefnfor agored.I'r perwyl hwn, defnyddiwyd gwrthSMASH yn gyntaf ar gyfer pob MAG, SAG, a REF a ddarganfuwyd mewn 1038 o fetagenomau morol (dulliau) i ragweld cyfanswm o 39,055 BGC.Yna fe wnaethom grwpio'r rhain yn 6907 o GCFs nad oedd eu hangen a 151 o boblogaethau clwstwr genynnau (GCCs; Tabl Atodol 2 a dulliau) i gyfrif am ddiswyddo cynhenid ​​(hy, gellir amgodio'r un BGC mewn genomau lluosog) a data metagenomig Darnio BGCs crynodedig .Ni chynyddodd BGCs anghyflawn yn sylweddol, os o gwbl (Gwybodaeth Atodol), nifer y GCFs a GCCs, yn y drefn honno, yn cynnwys o leiaf un aelod BGC cyfan mewn 44% ac 86% o achosion.
Ar lefel GCC, canfuom amrywiaeth eang o RiPPs a ragfynegwyd a chynhyrchion naturiol eraill (Ffig. 2a).Yn eu plith, er enghraifft, mae arylpolyenau, carotenoidau, ectoinau, a siderophores yn perthyn i GCCs â dosbarthiad ffylogenetig eang a digonedd uchel mewn metagenomau cefnforol, a all ddangos addasiad eang o ficro-organebau i'r amgylchedd morol, gan gynnwys ymwrthedd i rywogaethau ocsigen adweithiol, straen ocsideiddiol ac osmotig..neu amsugno haearn (mwy o wybodaeth).Mae'r amrywiaeth swyddogaethol hon yn cyferbynnu â dadansoddiad diweddar o tua 1.2 miliwn o BGCs ymhlith tua 190,000 o genomau sydd wedi'u storio yng nghronfa ddata NCBI RefSeq (BiG-FAM/RefSeq, y cyfeirir ati yma wedi hyn fel RefSeq)29, a ddangosodd fod peptidau Synthetase anribosomaidd (NRPS) a synthase polyketid. (PKS) BGCs (Gwybodaeth Atodol).Canfuom hefyd fod 44 (29%) GCCs yn ymwneud yn bell yn unig ag unrhyw GCC RefSeq (\(\bar{d}\)RefSeq> 0.4; Ffig. 2a a dulliau) a 53 (35%) GCC yn unig yn MAG , gan amlygu'r potensial i ganfod cemegau nas disgrifiwyd o'r blaen mewn OMD.O ystyried ei bod yn debygol bod pob un o’r GCCs hyn yn cynrychioli swyddogaethau biosynthetig hynod amrywiol, dadansoddwyd data gennym ymhellach ar lefel GCF mewn ymdrech i ddarparu grŵp manylach o BGCs y rhagwelir y byddant yn codio ar gyfer cynhyrchion naturiol tebyg29.Nododd cyfanswm o 3861 (56%) nad oedd GCFs yn gorgyffwrdd â RefSeq, ac nid oedd >97% o GCFs yn bresennol yn MIBIG, un o’r cronfeydd data mwyaf o BGCs a ddilyswyd yn arbrofol (Ffigur 2b).Er nad yw’n syndod darganfod llawer o lwybrau newydd posibl mewn lleoliadau nad ydynt yn cael eu cynrychioli’n dda gan y genom cyfeirio, mae ein dull o ddad-ddyblygu BGCs yn GCFs cyn meincnodi yn wahanol i adroddiadau blaenorol 16 ac yn caniatáu inni ddarparu asesiad diduedd o newydd-deb.Mae'r rhan fwyaf o'r amrywiaeth newydd (3012 GCF neu 78%) yn cyfateb i terpenau a ragwelir, RiPP neu gynhyrchion naturiol eraill, ac mae'r rhan fwyaf (1815 GCF neu 47%) wedi'i amgodio mewn mathau anhysbys oherwydd eu potensial biosynthetig.Yn wahanol i glystyrau PKS a NRPS, mae'r BGCs cryno hyn yn llai tebygol o fod yn dameidiog yn ystod cynulliad metagenomig 31 ac yn caniatáu mwy o nodweddu swyddogaethol eu cynhyrchion sy'n defnyddio mwy o amser ac adnoddau.
Cafodd cyfanswm o 39,055 o BGCs eu grwpio i 6,907 o GCF a 151 o GCC.a, cynrychioli data (allanol mewnol).Clystyru hierarchaidd o bellteroedd BGC yn seiliedig ar GCC, gyda 53 ohonynt yn cael eu pennu gan MAG yn unig.Mae'r GCC yn cynnwys BGCs o wahanol tacsa (amledd giât wedi'i drawsnewid ln) a dosbarthiadau BGC gwahanol (mae maint cylch yn cyfateb i'w amlder).Ar gyfer pob GCC, mae'r haen allanol yn cynrychioli nifer y BGCs, nifer yr achosion (canran y samplau), a'r pellter (isafswm pellter cosin BGC (min(dMIBiG))) o BiG-FAM i BGC.Amlygir GCCs gyda BGCs sydd â chysylltiad agos â BGCs a ddilyswyd yn arbrofol (MIBiG) â saethau.b Cymharu GCF â BGC a ragfynegwyd (BiG-FAM) a BGC wedi'u dilysu'n arbrofol (MIBIG), canfuwyd 3861 o GCFs newydd (d–>0.2).Mae'r rhan fwyaf (78%) o'r rhain yn codio ar gyfer RiPP, terpenes, a chynhyrchion naturiol tybiedig eraill.c, gosodwyd yr holl genomau yn yr OMD a ddarganfuwyd mewn 1038 o fetagenomau morol yn y goeden sylfaen GTDB i ddangos cwmpas ffylogenetig yr OMD.Mae cladinau heb unrhyw genomau yn yr OMD yn cael eu dangos mewn llwyd.Mae nifer y BGCs yn cyfateb i'r nifer fwyaf o BGCs a ragwelir fesul genom mewn clâd penodol.Er eglurder, mae'r 15% olaf o'r nodau wedi'u cwympo.Mae saethau'n dynodi cladau sy'n gyfoethog mewn BGC (>15 BGC), ac eithrio Mycobacterium, Gordonia (ail yn unig i Rhodococcus), a Crocosphaera (yn ail yn unig i Synechococcus).d, Anhysbys c.Dangosodd Eremiobacterota yr amrywiaeth biosynthetig uchaf (mynegai Shannon yn seiliedig ar y math o gynnyrch naturiol).Mae pob band yn cynrychioli'r genom gyda'r nifer fwyaf o BGCs yn y rhywogaeth.T1PKS, PKS math I, T2/3PKS, PKS math II a math III.
Yn ogystal â chyfoeth a newydd-deb, rydym yn archwilio strwythur bioddaearyddol potensial biosynthetig y microbiome morol.Roedd grwpio samplau yn ôl dosbarthiad rhif copi GCF metagenomig cyfartalog (Dulliau) yn dangos bod cymunedau lledred isel, wyneb, cyfoethog procaryotig a firws-dlawd, yn bennaf o ddŵr wyneb neu ddyfroedd haul dyfnach, yn gyfoethog mewn terpenau RiPP a BGC.Mewn cyferbyniad, roedd cymunedau pegynol, dwfn y môr, firws a chyfoeth o ronynnau yn gysylltiedig â digonedd uwch o NRPS a PKS BGC (data estynedig, Ffig. 4 a gwybodaeth ychwanegol).Yn olaf, canfuom mai cymunedau trofannol ac eigioneg sydd wedi'u hastudio'n dda yw'r ffynonellau mwyaf addawol o terpenau newydd (Ffigur Data Estynedig).Potensial uchaf ar gyfer PKS, RiPP a chynhyrchion naturiol eraill (Ffigur 5a gyda data estynedig).
I gyd-fynd â'n hastudiaeth o botensial biosynthetig microbiomau morol, anelwyd at fapio eu dosbarthiad ffylogenetig a nodi cladau newydd wedi'u cyfoethogi gan BGC.I'r perwyl hwn, rydym yn gosod y genomau o ficrobau morol i mewn i normaleiddio GTDB13 bacteriol a phylogenetic coeden archaeol a thrososod y llwybrau biosynthetic tybiedig y maent yn amgodio (Ffig. 2c).Rydym wedi canfod yn hawdd sawl cladin wedi’u cyfoethogi gan BGC (a gynrychiolir gan dros 15 BGCs) mewn samplau dŵr môr (dulliau) sy’n adnabyddus am eu potensial biosynthetig, megis cyanobacteria (Synechococcus) a bacteria Proteus, fel Tistrella32,33, neu wedi denu sylw yn ddiweddar am eu potensial. cynhyrchion naturiol.megis Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus a Planctomycetota34,35,36.Yn ddiddorol, canfuwyd nifer o linachau heb eu harchwilio o'r blaen yn y cladau hyn.Er enghraifft, roedd y rhywogaethau hynny â'r potensial biosynthetig cyfoethocaf yn y ffyla Planctomycetota a Myxococcota yn perthyn i urddau ymgeisydd annodweddiadol a genera, yn y drefn honno (Tabl Atodol 3).Gyda'i gilydd, mae hyn yn awgrymu bod yr OMD yn darparu mynediad i wybodaeth ffylogenetig nad oedd yn hysbys o'r blaen, gan gynnwys micro-organebau, a allai gynrychioli targedau newydd ar gyfer darganfod ensymau a chynnyrch naturiol.
Nesaf, fe wnaethom nodweddu'r clâd a gyfoethogwyd gan BGC trwy nid yn unig gyfrif yr uchafswm o BGCs a amgodiwyd gan ei aelodau, ond hefyd trwy asesu amrywiaeth y BGCs hyn, sy'n esbonio amlder gwahanol fathau o gynhyrchion ymgeisydd naturiol (Ffig. 2c a dulliau )..Canfuom fod y rhywogaethau biosynthetig mwyaf amrywiol yn cael eu cynrychioli gan MAGs bacteriol a luniwyd yn arbennig yn yr astudiaeth hon.Mae'r bacteria hyn yn perthyn i'r ffylwm Candidatus Eremiobacterota heb ei drin, nad yw wedi'i archwilio i raddau helaeth ar wahân i rai astudiaethau genomig37,38.Mae'n werth nodi bod “ca.Dim ond mewn amgylchedd daearol39 y mae'r genws Eremiobacterota wedi'i ddadansoddi ac nid yw'n hysbys ei fod yn cynnwys unrhyw aelodau sydd wedi'u cyfoethogi yn BGC.Yma rydym wedi ail-greu wyth MAG o'r un rhywogaeth (hunaniaeth niwcleotid > 99%) 23. Felly rydym yn cynnig yr enw rhywogaeth “Candidatus Eudoremicrobium malaspinii”, a enwyd ar ôl y nereid (nymff môr), anrheg hardd ym mytholeg ac alldeithiau Groeg.'Ka.Yn ôl anodiad ffylogenetig 13, nid oes gan E. malaspinii berthnasau hysbys yn flaenorol o dan lefel y dilyniant ac felly mae'n perthyn i deulu bacteriol newydd yr ydym yn ei gynnig “Ca.E. malaspinii” fel y rhywogaeth math a “Ca.Eudormicrobiaceae” fel yr enw swyddogol (Gwybodaeth Atodol).Adluniad metagenomig byr o 'Ca.Dilyswyd prosiect genom E. malaspinii gan fewnbwn isel iawn, dilyniant metagenomig darllen hir a chydosod wedi'i dargedu o sampl sengl (Dulliau) fel cromosom llinol sengl 9.63 Mb gyda dyblygu o 75 kb.fel yr unig amwysedd sydd ar ôl.
Er mwyn sefydlu cyd-destun ffylogenetig y rhywogaeth hon, buom yn chwilio am 40 o rywogaethau â chysylltiad agos mewn samplau metagenomig ychwanegol wedi'u cyfoethogi gan ewcaryotig o alldaith Cefnfor Tara trwy ail-greu genom wedi'i dargedu.Yn gryno, rydym wedi cysylltu darlleniadau metagenomig â darnau genomig sy'n gysylltiedig â “Ca.E. malaspinii” a damcaniaethodd fod cyfradd recriwtio uwch yn y sampl hwn yn dangos presenoldeb perthnasau eraill (dulliau).O ganlyniad, canfuwyd 10 MAG, sef cyfuniad o 19 MAG yn cynrychioli pum rhywogaeth mewn tri genera o fewn teulu newydd ei ddiffinio (hy “Ca. Eudormicrobiaceae”).Ar ôl archwilio â llaw a rheoli ansawdd (data estynedig, Ffig. 6 a gwybodaeth ychwanegol), canfuom fod “Ca.Mae rhywogaethau Eudormicrobiaceae yn cyflwyno genomau mwy (8 Mb) a photensial biosynthetig cyfoethocach (14 i 22 BGC fesul rhywogaeth) nag aelodau “Ca” eraill.Clade Eremiobacterota (hyd at 7 BGC) (Ffig. 3a–c).
a, Sefyllfa ffylogenetig y pum' Ca.Dangosodd rhywogaethau o Eudormicrobiaceae gyfoeth BGC sy'n benodol i'r llinellau morol a nodwyd yn yr astudiaeth hon.Mae'r goeden ffylogenetig yn cynnwys yr holl 'Ca.Defnyddiwyd MAG Eremiobacterota ac aelodau o ffyla eraill (rhifau genom mewn cromfachau) a ddarparwyd yn GTDB (fersiwn 89) ar gyfer cefndir esblygiadol (Dulliau).Mae'r haenau allanol yn cynrychioli dosbarthiadau ar lefel y teulu (“Ca. Eudormicrobiaceae” a “Ca. Xenobiaceae”) ac ar lefel dosbarth (“Ca. Eremiobacteria”).Cynrychiolir y pum rhywogaeth a ddisgrifir yn yr astudiaeth hon gan godau alffaniwmerig ac enwau binomaidd arfaethedig (Gwybodaeth Atodol).b, iawn.Mae rhywogaethau Eudormicrobiaceae yn rhannu saith cnewyllyn BGC cyffredin.Roedd absenoldeb BGC yn y clâd A2 oherwydd anghyflawnder y MAG cynrychioliadol (Tabl Atodol 3).Mae BGCs yn benodol i “Ca.Amphithomicrobium" a "Ca.Ni ddangosir amffithomicrobium” (cladinau A a B).c, Pob BGC wedi'i amgodio fel “Ca.Canfuwyd bod Eudoremicrobium taraoceanii wedi'i fynegi mewn 623 o fetadrawsysgrifau a gymerwyd o gefnforoedd Tara.Mae cylchoedd solet yn dynodi trawsgrifiad gweithredol.Mae cylchoedd oren yn dynodi newidiadau plygiad log2-drawsnewidiol islaw ac uwchlaw cyfradd mynegiant genynnau cadw tŷ (dulliau).d, cromliniau digonedd cymharol (dulliau) yn dangos 'Ca.Mae rhywogaethau o Eudormicrobiaceae yn gyffredin yn y rhan fwyaf o fasnau cefnforol ac yn y golofn ddŵr gyfan (o'r wyneb i ddyfnder o 4000 m o leiaf).Yn seiliedig ar yr amcangyfrifon hyn, canfuwyd bod 'Ca.Mae E. malaspinii' yn cyfrif am hyd at 6% o gelloedd procaryotig mewn cymunedau sy'n gysylltiedig â grawn pelagig môr dwfn.Fe wnaethom ystyried bod rhywogaeth yn bresennol ar safle os canfuwyd hi mewn unrhyw ffracsiwn o faint haen dyfnder penodol.IO - Cefnfor India, NAO - Gogledd yr Iwerydd, NPO - Gogledd y Môr Tawel, RS - Môr Coch, SAO - De'r Iwerydd, SO - Cefnfor y De, SPO - De'r Môr Tawel.
Wrth astudio helaethrwydd a dosbarthiad Ca.Eudormicrobiaceae, sydd, fel y gwelsom, yn bennaf yn y rhan fwyaf o fasnau cefnforol, yn ogystal ag yn y golofn ddŵr gyfan (Ffig. 3d).Yn lleol, maent yn cyfrif am 6% o'r gymuned ficrobaidd forol, sy'n eu gwneud yn rhan bwysig o'r microbiome morol byd-eang.Yn ogystal, canfuwyd cynnwys cymharol Ca.Roedd rhywogaethau Eudormicrobiaceae a'u lefelau mynegiant BGC ar eu huchaf yn y ffracsiwn cyfoethogi ewcaryotig (Ffig. 3c a data estynedig, Ffig. 7), sy'n nodi rhyngweithio posibl â mater gronynnol, gan gynnwys plancton.Mae'r sylw hwn yn debyg iawn i 'Ca.Gall BGCs Eudoremicrobium sy'n cynhyrchu cynhyrchion naturiol sytotocsig trwy lwybrau hysbys ddangos ymddygiad rheibus (Gwybodaeth Atodol a Data Ehangedig, Ffigur 8), yn debyg i ysglyfaethwyr eraill sy'n cynhyrchu metabolion yn benodol fel Myxococcus41.Darganfod Ca.Gall Eudormicrobiaceae mewn samplau llai sydd ar gael (cefnfor dwfn) neu ewcaryotig yn hytrach na phrocaryotig esbonio pam mae'r bacteria hyn a'u hamrywiaeth BGC annisgwyl yn parhau i fod yn aneglur yng nghyd-destun ymchwil bwyd naturiol.
Yn y pen draw, fe wnaethom ni geisio dilysu'n arbrofol addewid ein gwaith seiliedig ar ficrobiomau wrth ddarganfod llwybrau, ensymau a chynhyrchion naturiol newydd.Ymhlith y gwahanol ddosbarthiadau o BGCs, gwyddys bod y llwybr RiPP yn amgodio amrywiaeth gemegol a swyddogaethol gyfoethog oherwydd amrywiol addasiadau ôl-gyfieithu o'r peptid craidd gan ensymau aeddfed42.Felly dewison ni ddau 'Ca.Mae BGCs RiPP Eudoremicrobium (Ffigurau 3b a 4a-e) yn seiliedig ar yr un peth ag unrhyw BGC hysbys (\(\bar{d}\)MIBIG a \(\bar{d}\)RefSeq uchod 0.2).
a–c, Mynegiant heterologaidd In vitro a phrofion ensymatig in vitro o glwstwr newydd (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) o biosynthesis RiPP sy'n benodol ar gyfer rhywogaethau môr dwfn Ca.Arweiniodd E. malaspinii' at gynhyrchu cynhyrchion deuffosfforyleiddiad.c, addasiadau a nodwyd gan ddefnyddio cydraniad uchel (AD) MS/MS (darnio a nodir gan ïonau b ac y yn y strwythur cemegol) a NMR (data estynedig, Ffig. 9).d, mae'r peptid ffosfforylaidd hwn yn arddangos ataliad micromolar isel o neutrophil elastase mamalaidd, nad yw i'w gael yn y peptid rheoli a'r peptid dadhydradu (dadhydradiad a achosir gan dynnu cemegol).Ailadroddwyd yr arbrawf dair gwaith gyda chanlyniadau tebyg.Er enghraifft, mae mynegiant heterologaidd ail glwstwr biosynthesis protein nofel \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) yn egluro swyddogaeth pedwar ensym aeddfed sy'n addasu'r 46 peptid craidd asid amino.Mae gweddillion yn cael eu staenio yn ôl safle'r addasiad a ragwelir gan HR-MS/MS, labelu isotopau, a dadansoddiad NMR (Gwybodaeth Atodol).Mae lliwiad doriad yn dangos bod yr addasiad yn digwydd yn y naill neu'r llall o'r ddau weddillion.Mae'r ffigur yn gasgliad o luniadau heterologaidd niferus i ddangos gweithgaredd yr holl ensymau aeddfed ar yr un cnewyllyn.h, Darlun o ddata NMR ar gyfer asgwrn cefn amide N-methylation.Dangosir canlyniadau llawn yn ffig.10 gyda data estynedig.i, Mae sefyllfa ffylogenetig yr ensym clwstwr protein FkbM aeddfed ymhlith yr holl barthau FkbM a geir yng nghronfa ddata MIBIG 2.0 yn datgelu ensym o'r teulu hwn â gweithgaredd N-methyltransferase (Gwybodaeth Atodol).Dangosir diagramau sgematig o BGCs (a, e), adeileddau peptid rhagflaenol (b, f), a strwythurau cemegol tybiedig cynhyrchion naturiol (c, g).
Dim ond mewn rhywogaethau môr dwfn “Ca.E. malaspinii” a chodau ar gyfer Peptide- rhagflaenydd (Ffig. 4a, b).Yn yr ensym aeddfed hwn, rydym wedi nodi un parth swyddogaethol homologaidd i'r parth dadhydradu o lantipeptide synthase sydd fel arfer yn cataleiddio ffosfforyleiddiad a chael gwared ar 43 (Gwybodaeth Atodol) wedi hynny.Felly, rydym yn rhagweld bod addasu'r peptid rhagflaenol yn cynnwys dadhydradiad dau gam o'r fath.Fodd bynnag, gan ddefnyddio sbectrometreg màs tandem (MS / MS) a sbectrosgopeg cyseiniant magnetig niwclear (NMR), fe wnaethom nodi peptid llinol polyffosfforylaidd (Ffig. 4c).Er ei fod yn annisgwyl, canfuom sawl llinell o dystiolaeth i gefnogi ei fod yn gynnyrch terfynol: dau westeiwr heterologaidd gwahanol a dim dadhydradu mewn profion in vitro, nodi gweddillion allweddol wedi'u treiglo yn safle dadhydradu catalytig yr ensym aeddfed.i gyd wedi'u hail-greu gan “Ca”.Mae genom E. malaspinii (data estynedig, Ffig. 9 a gwybodaeth ychwanegol) ac, yn olaf, y gweithgaredd biolegol y cynnyrch phosphorylated, ond nid yw'r ffurflen dadhydradu syntheseiddio gemegol (Ffig. 4d).Mewn gwirionedd, canfuom ei fod yn arddangos gweithgaredd ataliol proteas micromolar isel yn erbyn neutrophil elastase, sy'n debyg i gynhyrchion naturiol cysylltiedig eraill yn yr ystod crynodiad (IC50 = 14.3 μM) 44 , er gwaethaf y ffaith nad yw'r rôl ecolegol wedi'i hegluro o hyd.Ar sail y canlyniadau hyn, cynigiwn enwi’r llwybr yn “phospheptin”.
Mae'r ail achos yn llwybr RiPP cymhleth sy'n benodol i 'Ca.Rhagwelwyd y byddai'r genws Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0.46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0.33) yn amgodio cynhyrchion protein naturiol (Ffig. 4e).Mae'r llwybrau hyn o ddiddordeb biotechnolegol arbennig oherwydd y dwysedd disgwyliedig a'r amrywiaeth o addasiadau cemegol anarferol a sefydlwyd gan yr ensymau a amgodiwyd gan y BGCs cymharol fyr45.Canfuom fod y protein hwn yn wahanol i broteinau a nodweddwyd yn flaenorol gan nad oes ganddo'r prif fotiff NX5N o polyceramidau a dolen lanthionin o landornamides 46 .Er mwyn goresgyn cyfyngiadau patrymau mynegiant heterologaidd cyffredin, fe wnaethom eu defnyddio ynghyd â system aerodenitrificans Microvirgula arferol i nodweddu pedwar ensymau llwybr aeddfed (dulliau).Gan ddefnyddio cyfuniad o MS / MS, labelu isotop, a NMR, canfuwyd yr ensymau aeddfed hyn yng nghraidd asid 46-amino y peptid (Ffig. 4f, g, data estynedig, Ffig. 10-12 a gwybodaeth ychwanegol).Ymhlith ensymau aeddfed, fe wnaethom nodweddu ymddangosiad cyntaf aelod o'r teulu FkbM O-methyltransferase 47 yn y llwybr RiPP a chanfuwyd yn annisgwyl bod yr ensym aeddfed hwn yn cyflwyno asgwrn cefn N-methylation (Ffig. 4h, i a gwybodaeth ychwanegol).Er bod yr addasiad hwn yn hysbys mewn cynhyrchion NRP48 naturiol, mae N-methylation ensymatig bondiau amid yn adwaith cymhleth ond biotechnolegol arwyddocaol49 sydd hyd yma wedi bod o ddiddordeb i'r teulu RiPP o borosinau.Penodoldeb 50,51.Gall nodi'r gweithgaredd hwn mewn teuluoedd eraill o ensymau a RiPP agor cymwysiadau newydd ac ehangu amrywiaeth swyddogaethol proteinau 52 a'u hamrywiaeth cemegol.Yn seiliedig ar yr addasiadau a nodwyd a hyd anarferol y strwythur cynnyrch arfaethedig, rydym yn cynnig enw llwybr “pythonamide”.
Mae darganfod ensymoleg annisgwyl mewn teulu o ensymau â nodweddion swyddogaethol yn dangos yr addewid o genomeg amgylcheddol ar gyfer darganfyddiadau newydd, ac mae hefyd yn dangos y gallu cyfyngedig ar gyfer casgliad swyddogaethol yn seiliedig ar homoleg dilyniant yn unig.Felly, ynghyd ag adroddiadau am RiPPs polyffosfforyleiddiad bioactif an-ganonaidd, mae ein canlyniadau'n dangos gwerth adnoddau-ddwys ond hanfodol i ymdrechion bioleg synthetig i ddadorchuddio'n llawn gyfoeth swyddogaethol, amrywiaeth, a strwythurau anarferol cyfansoddion biocemegol.
Yma rydym yn dangos yr ystod o botensial biosynthetig sydd wedi'i amgodio gan ficrobau a'u cyd-destun genomig yn y microbiome morol byd-eang, gan hwyluso ymchwil yn y dyfodol trwy sicrhau bod yr adnodd canlyniadol ar gael i'r gymuned wyddonol (https://microbiomics.io/ocean/).Canfuom mai dim ond trwy ail-greu MAGs a SAGs y gellir cael llawer o'i newydd-deb ffylogenetig a swyddogaethol, yn enwedig mewn cymunedau microbaidd nad ydynt yn cael eu defnyddio'n ddigonol a allai arwain ymdrechion bio-arolygu yn y dyfodol.Er y byddwn yn canolbwyntio yma ar 'Ca.Eudormicrobiaceae” fel llinach yn enwedig “talentog” yn fiosynthetig, mae llawer o’r BGCs a ragfynegwyd yn y microbiota heb ei ddarganfod yn debygol o amgodio ensymolegau nas disgrifiwyd yn flaenorol sy’n cynhyrchu cyfansoddion â chamau gweithredu sy’n arwyddocaol yn amgylcheddol a/neu yn fiodechnolegol.
Cynhwyswyd setiau data metagenomig o astudiaethau eigioneg a chyfresi amser mawr gyda dyfnder dilyniannu digonol i gynyddu cwmpas cymunedau microbaidd morol byd-eang mewn basnau cefnfor, haenau dwfn a thros amser.Mae'r setiau data hyn (Tabl Atodol 1 a Ffigur 1) yn cynnwys metagenomeg o samplau a gasglwyd yng nghefnforoedd Tara (cyfoethogiad firaol, n=190; cyfoethogi procaryotig, n=180)12,22 a'r alldaith BioGEOTRACES (n=480).Cyfres Amser Cefnforol Hawaii (HOT, n = 68), Cyfres Amser Bermuda-Iwerydd (BATS, n = 62)21 ac Alldaith Malaspina (n = 58)23.Cafodd darlleniadau dilyniannu o bob darn metagenomig eu hidlo am ansawdd gan ddefnyddio BBMap (v.38.71) trwy dynnu addaswyr dilyniannu o ddarlleniadau, tynnu darlleniadau wedi'u mapio i ddilyniannau rheoli ansawdd (genomau PhiX), a defnyddio trimq=14, maq=20 yn taflu ansawdd darllen gwael, maxns = 0 a minlength = 45. Cafodd dadansoddiadau dilynol eu rhedeg neu eu huno â darlleniadau QC os nodir hynny (bbmerge.sh minoverlap=16).Cafodd darlleniadau QC eu normaleiddio (targed bbnorm.sh = 40, minddepth = 0) cyn adeiladu gan ddefnyddio metaSPAdes (adn.3.11.1 neu v.3.12 os oes angen)53.Yn olaf, cafodd y contigs sgaffald canlyniadol (y cyfeirir atynt o hyn ymlaen fel sgaffaldiau) eu hidlo yn ôl hyd (≥1 kb).
Rhannwyd y 1038 o samplau metagenomig yn grwpiau, ac ar gyfer pob grŵp o samplau, cafodd darlleniadau rheoli ansawdd metagenomig yr holl samplau eu paru â chromfachau pob sampl ar wahân, gan arwain at y nifer ganlynol o ddarlleniadau grŵp mewn cromfachau pâr: Feirysau Morol Tara - Cyfoethog (190 × 190 ), Prokaryotes Wedi'u Cyfoethogi (180 × 180), BioGEOTRACES, POETH a BATS (610 × 610) a Malaspina (58 × 58).Gwnaed y gwaith mapio gan ddefnyddio Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 sy'n caniatáu i ddarlleniadau gael eu paru â safleoedd eilaidd (gan ddefnyddio'r faner -a).Cafodd aliniadau eu hidlo i fod o leiaf 45 sylfaen o hyd, â hunaniaeth ≥97%, a rhychwant ≥80% yn darllen.Proseswyd y ffeiliau BAM a ddeilliodd o hynny gan ddefnyddio'r sgript jgi_summarize_bam_contig_depths ar gyfer MetaBAT2 (v.2.12.1)55 i ddarparu cwmpas o fewn sampl a rhyng-sampl ar gyfer pob grŵp.Yn olaf, grwpiwyd cromfachau i gynyddu sensitifrwydd trwy redeg MetaBAT2 yn unigol ar bob sampl gyda –minContig 2000 a –maxEdges 500. Rydym yn defnyddio MetaBAT2 yn lle bocsiwr ensemble oherwydd dangoswyd mewn profion annibynnol mai hwn yw'r bocsiwr sengl mwyaf effeithiol.a 10 i 50 gwaith yn gyflymach na phaffwyr eraill a ddefnyddir yn gyffredin57.Er mwyn profi effaith cydberthnasau helaethrwydd, defnyddiodd is-sampl o fetagenomeg a ddewiswyd ar hap (10 ar gyfer pob un o'r ddwy set ddata Tara Ocean, 10 ar gyfer BioGEOTRACES, 5 ar gyfer pob cyfres amser, a 5 ar gyfer Malaspina) samplau yn ychwanegol yn unig.Mae samplau mewnol yn cael eu grwpio i gael gwybodaeth cwmpas.(Gwybodaeth Ychwanegol).
Cynhwyswyd genomau ychwanegol (allanol) yn y dadansoddiad dilynol, sef 830 MAG a ddewiswyd â llaw o is-set o set ddata Tara Oceans26, 5287 SAG o set ddata GORG20, a data o gronfa ddata MAR (MarDB v. 4) o 1707 o REFs ynysig a 682 SAGs) 27. Ar gyfer set ddata MarDB, dewisir genomau ar sail metadata sydd ar gael os yw'r math o sampl yn cyfateb i'r mynegiad rheolaidd canlynol: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] ynysig'.
Aseswyd ansawdd pob cynhwysydd metagenomig a genomau allanol gan ddefnyddio CheckM (v.1.0.13) ac Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59.Os yw CheckM neu Anvi'o yn adrodd ≥50% cyflawnder/cyflawnder a ≤10% o halogiad/diweithrededd, yna arbedwch gelloedd metagenomig a genomau allanol i'w dadansoddi'n ddiweddarach.Yna cyfunwyd y sgorau hyn yn gyflawnder cymedrig (mcpl) a halogiad cymedrig (mctn) i ddosbarthu ansawdd genom yn unol â meini prawf cymunedol60 fel a ganlyn: ansawdd uchel: mcpl ≥ 90% a mctn ≤ 5%;ansawdd da: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, ansawdd canolig: mcpl ≥ 50% a mctn ≤ 10%, ansawdd teg: mcpl ≤ 90% neu mctn ≥ 10%.Yna cafodd y genomau wedi'u hidlo eu cydberthyn â sgoriau ansawdd (Q a Q') fel a ganlyn: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (amrywioldeb straen)/100 + 0.5 x log[N50] .(a weithredwyd yn dRep61).
Er mwyn caniatáu dadansoddiad cymharol rhwng gwahanol ffynonellau data a mathau o genomau (MAG, SAG a REF), dadgyfeiriwyd 34,799 o genomau yn seiliedig ar hunaniaeth niwcleotid gyfartalog genom gyfan (ANI) gan ddefnyddio dRep (v.2.5.4).Yn ailadrodd)61 gyda throthwyau ANI 95%28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0.2) a genynnau marcio un copi gan ddefnyddio SpecI63 yn darparu clystyru genom ar lefel y rhywogaeth.Dewiswyd genom cynrychioliadol ar gyfer pob clwstwr dRep yn ôl y sgôr ansawdd uchaf (Q') a ddiffiniwyd uchod, a ystyriwyd yn gynrychioliadol o'r rhywogaeth.
I werthuso'r cyflymder mapio, defnyddiwyd BWA (v.0.7.17-r1188, -a) i fapio pob un o'r 1038 set o ddarlleniadau metagenomig gyda 34,799 o genomau yn yr OMD.Mapiwyd darlleniadau a reolir gan ansawdd mewn modd un pen a chafodd yr aliniadau canlyniadol eu hidlo i gadw aliniadau ≥45 bp yn unig.a hunaniaeth ≥95%.Y gymhareb arddangos ar gyfer pob sampl yw canran y darlleniadau sy'n weddill ar ôl hidlo wedi'i rannu â chyfanswm nifer y darlleniadau rheoli ansawdd.Gan ddefnyddio'r un dull, gostyngwyd pob un o'r metagenomau 1038 i 5 miliwn o fewnosodiadau (data estynedig, Ffig. 1c) a'u cyfateb i GORG SAG yn OMD ac ym mhob GEM16.Pennwyd faint o MAGs a adferwyd o ddŵr môr yng nghatalog GEM16 gan ymholiadau allweddair o ffynonellau metagenomig, gan ddewis samplau dŵr môr (ee, yn hytrach na gwaddodion morol).Yn benodol, rydym yn dewis “dyfrol” fel “ecosystem_category”, “morol” fel “ecosystem_type”, ac yn hidlo “cynefin” fel “cefnfor dwfn”, “morol”, “cefnforol morol”, “morol cefnforol”, “dŵr morol”, “Cefnfor”, “Dŵr Môr”, “Dŵr Môr Arwyneb”, “Dŵr Môr Arwyneb”.Arweiniodd hyn at ddosbarthu 5903 MAGs (734 o ansawdd uchel) dros 1823 OTUs (gweler yma ).
Cafodd genomau procaryotig eu hanodi'n dacsonomaidd gan ddefnyddio GTDB-Tk (v.1.0.2)64 gyda pharamedrau rhagosodedig yn targedu GTDB r89 fersiwn 13. Defnyddiwyd Anvi'o i nodi genomau ewcaryotig yn seiliedig ar ragfynegiad parth ac adalw ≥50% a diswyddo ≤ 10%.Diffinnir anodi tacsonomig rhywogaeth fel un o'i genomau cynrychioliadol.Ac eithrio ewcaryotau (148 MAG), cafodd pob genom ei anodi'n swyddogaethol gyntaf gan ddefnyddio prokka (adn.14.5)65, gan enwi genynnau cyflawn, gan ddiffinio paramedrau “archaea” neu “bacteria” yn ôl yr angen, a adroddir hefyd ar gyfer rhai nad ydynt yn genynnau codio.a rhanbarthau CRISPR, ymhlith nodweddion genomig eraill.Anodi genynnau rhagfynegedig trwy nodi genynnau marcio un copi cyffredinol (uscMG) gan ddefnyddio fetchMG (v.1.2)66, aseinio grwpiau ortholog ac ymholiad gan ddefnyddio emapper (adn.2.0.1)67 yn seiliedig ar eggNOG (v.5.0)68.Cronfa ddata KEGG (cyhoeddwyd Chwefror 10, 2020) 69. Perfformiwyd y cam olaf trwy baru proteinau â chronfa ddata KEGG gan ddefnyddio DIAMOND (v.0.9.30)70 gydag ymholiad a sylw i bwnc o ≥70%.Cafodd y canlyniadau eu hidlo ymhellach yn ôl Piblinell Anodiadau Genom Procaryotig NCBI71 yn seiliedig ar bitrate ≥ 50% o'r gyfradd didau disgwyliedig uchaf (dolen ei hun).Defnyddiwyd dilyniannau genynnau hefyd fel mewnbwn i nodi BGCs yn y genom gan ddefnyddio antiSMASH (v.5.1.0)72 gyda pharamedrau rhagosodedig a ffrwydradau clwstwr gwahanol.Mae'r holl genomau ac anodiadau wedi'u crynhoi yn OMD ynghyd â metadata cyd-destunol sydd ar gael ar y we (https://microbiomics.io/ocean/).
Yn debyg i ddulliau a ddisgrifiwyd yn flaenorol12,22 defnyddiwyd CD-HIT (v.4.8.1) i glystyru >56.6 miliwn o enynnau codio protein o genomau bacteriol ac archaeol o OMD i genynnau hunaniaeth 95% a genynnau byrrach (cynhwysiad o 90%)73 hyd at >17.7 miliwn o glystyrau genynnau.Dewiswyd y dilyniant hiraf fel y genyn cynrychioliadol ar gyfer pob clwstwr genynnau.Yna cafodd y metagenomau 1038 eu paru â> 17.7 miliwn o aelodau clwstwr BWA (-a) a chafodd y ffeiliau BAM dilynol eu hidlo i gadw dim ond aliniadau â hunaniaeth ≥95% y cant ac aliniadau sylfaen ≥45.Cyfrifwyd helaethrwydd genynnau hyd-normaleiddio trwy gyfrif mewnosodiadau o'r aliniad unigryw gorau yn gyntaf ac yna, ar gyfer mewnosodiadau niwlog, ychwanegu cyfrif ffracsiynol at y genynnau targed cyfatebol sy'n gymesur â'u nifer o fewnosodiadau unigryw.
Ychwanegwyd y genomau o'r OMD estynedig (gyda MAGs ychwanegol o “Ca. Eudormicrobiaceae”, gweler isod) at gronfa ddata offer dadansoddi metagenomig mOTUs74 (adn.2.5.1) i greu cronfa ddata gyfeirio mOTU estynedig.Dim ond chwe genom un copi (23,528 genom) a oroesodd allan o ddeg uscMG.Arweiniodd ehangu'r gronfa ddata at 4,494 o glystyrau ychwanegol ar lefel rhywogaethau.Dadansoddwyd 1038 o fetagenomau gan ddefnyddio paramedrau mOTU rhagosodedig (v.2).Ni chanfuwyd cyfanswm o 989 o genomau mewn 644 o glystyrau mOTU (95% REF, 5% SAG a 99.9% yn perthyn i MarDB) gan y proffil mOTU.Mae hyn yn adlewyrchu ffynonellau ychwanegol amrywiol o ynysu genomau MarDB morol (mae'r rhan fwyaf o'r genomau heb eu canfod yn gysylltiedig ag organebau sydd wedi'u hynysu o waddodion, gwesteiwyr morol, ac ati).Er mwyn parhau i ganolbwyntio ar yr amgylchedd cefnfor agored yn yr astudiaeth hon, gwnaethom eu heithrio o'r dadansoddiad i lawr yr afon oni bai eu bod wedi'u canfod neu eu cynnwys yn y gronfa ddata mOTU estynedig a grëwyd yn yr astudiaeth hon.
Cyfunwyd pob BGC o MAG, SAG a REF yn OMD (gweler uchod) â BGCs a nodwyd ym mhob sgaffaldau metagenomig (antiSMASH v.5.0, paramedrau rhagosodedig) a nodweddwyd gan ddefnyddio BiG-SLICE (v.1.1) (parth PFAM )75.Yn seiliedig ar y nodweddion hyn, fe wnaethom gyfrifo'r holl bellteroedd cosin rhwng BGCs a'u grwpio (dolenni cymedrig) yn GCF a GCC gan ddefnyddio trothwyon pellter o 0.2 a 0.8 yn y drefn honno.Mae'r trothwyon hyn yn addasiad o drothwyon a ddefnyddiwyd yn flaenorol gan ddefnyddio pellter Ewclidaidd75 ynghyd â phellter cosin, sy'n lleddfu rhywfaint o'r gwall yn y strategaeth glystyru BiG-SLICE wreiddiol (Gwybodaeth Atodol).
Yna cafodd BGCs eu hidlo i gadw dim ond ≥5 kb wedi'i amgodio ar sgaffaldiau i leihau'r risg o ddarnio fel y disgrifiwyd yn flaenorol16 ac i eithrio REFs MarDB a SAGs nas canfuwyd mewn 1038 o fetagenomau (gweler uchod).Arweiniodd hyn at gyfanswm o 39,055 o BGCs yn cael eu hamgodio gan y genom OMD, gyda 14,106 ychwanegol wedi'u nodi ar ddarnau metagenomig (hy heb eu cyfuno'n MAGs).Defnyddiwyd y BGCs “metagenomig” hyn i amcangyfrif cyfran y potensial biosynthesis microbiome morol nad yw wedi’i gynnwys yn y gronfa ddata (Gwybodaeth Atodol).Nodweddwyd pob BGC yn swyddogaethol yn ôl mathau o gynnyrch rhagfynegol a ddiffinnir gan gategorïau cynnyrch gwrth-SMASH neu fwy bras a ddiffinnir yn BiG-SCAPE76.Er mwyn atal tuedd samplu mewn meintioli (cyfansoddiad tacsonomig a swyddogaethol GCC/GCF, pellter GCF a GCC i gronfeydd data cyfeirio, a helaethrwydd metagenomig GCF), trwy gadw'r BGC hiraf fesul GCF yn unig ar gyfer pob rhywogaeth, cafodd 39,055 o BGC eu dad-ddyblygu ymhellach, gan arwain at gyfanswm o 17,689 BGC.
Aseswyd newydd-deb GCC a GCF ar sail y pellter rhwng y gronfa ddata a gyfrifwyd (cronfa ddata RefSeq yn BiG-FAM)29 a'r BGC a ddilyswyd yn arbrofol (MIBIG 2.0)30.Ar gyfer pob un o'r 17,689 BGC cynrychioliadol, dewisom y pellter cosin lleiaf i'r gronfa ddata berthnasol.Yna caiff y pellteroedd lleiaf hyn eu cyfartaleddu (cymedr) yn ôl GCF neu GCC, fel y bo'n briodol.Ystyrir bod GCF yn newydd os yw'r pellter i'r gronfa ddata yn fwy na 0.2, sy'n cyfateb i wahaniad delfrydol rhwng y GCF (cyfartaledd) a'r cyfeirnod.Ar gyfer GCC, rydym yn dewis 0.4, sydd ddwywaith y trothwy a ddiffinnir gan GCF, i gloi mewn perthynas hirdymor â chysylltiadau.
Amcangyfrifwyd helaethrwydd metagenomig BGC fel helaethrwydd cyfartalog ei enynnau biosynthetig (fel y'i pennir gan gwrth-SMASH) sydd ar gael o broffiliau lefel genynnau.Yna cyfrifwyd helaethrwydd metagenomig pob GCF neu GCC fel swm y BGCs cynrychioliadol (allan o 17,689).Wedi hynny, cafodd y mapiau hyn eu normaleiddio ar gyfer cyfansoddiad cellog gan ddefnyddio'r cyfrif mOTU fesul sampl, a oedd hefyd yn cyfrif am ymdrechion dilyniannu (data estynedig, Ffig. 1d).Cyfrifwyd nifer yr achosion o GCF neu GCC fel canran y samplau â digonedd > 0.
Cyfrifwyd y pellter Ewclidaidd rhwng samplau o'r proffil GCF wedi'i normaleiddio.Lleihawyd maint y pellteroedd hyn gan ddefnyddio UMAP77 a defnyddiwyd y mewnosodiadau canlyniadol ar gyfer clystyru seiliedig ar ddwysedd heb oruchwyliaeth gan ddefnyddio HDBSCAN78.Mae’r nifer lleiaf optimaidd o bwyntiau ar gyfer clwstwr (ac felly nifer y clystyrau) a ddefnyddir gan HDBSCAN yn cael ei bennu trwy gynyddu’r tebygolrwydd cronnol o aelodaeth clwstwr.Profwyd y clystyrau a nodwyd (ac is-sampl cytbwys ar hap o'r clystyrau hyn i gyfrif am duedd mewn dadansoddiad aml-amrywedd cyfnewidiol o amrywiant (PERMANOVA)) am arwyddocâd yn erbyn pellteroedd Ewclidaidd heb eu lleihau gan ddefnyddio PERMANOVA.Cyfrifwyd maint genom cyfartalog y samplau ar sail helaethrwydd cymharol mOTU ac amcangyfrif o faint genom aelodau'r genomau.Yn benodol, amcangyfrifwyd maint genom cyfartalog pob mOTU fel cyfartaledd meintiau genom ei aelodau wedi'i gywiro i sicrhau cyflawnder (ar ôl hidlo) (er enghraifft, mae gan genom cyflawn 75% gyda hyd o 3 Mb faint wedi'i addasu o 4 Mb).ar gyfer genomau canolig gydag uniondeb ≥70%.Yna cyfrifwyd maint y genom cyfartalog ar gyfer pob sampl fel swm meintiau genomau mOTU wedi'i bwysoli gan helaethrwydd cymharol.
Dangosir set wedi'i hidlo o BGCs wedi'u hamgodio â genomau yn yr OMD mewn coed GTDB bacteriol ac archaeol (mewn fframweithiau ≥5 kb, ac eithrio REF a SAG MarDB nas canfuwyd yn 1038 metagenomau, gweler uchod) a'u categorïau cynnyrch a ragwelir yn seiliedig ar y ffylogenetig safle'r genom (gweler uchod).Yn gyntaf gwnaethom leihau'r data yn ôl rhywogaeth, gan ddefnyddio'r genom â'r nifer fwyaf o BGCs yn y rhywogaeth honno yn gynrychioliadol.Ar gyfer delweddu, rhannwyd y cynrychiolwyr ymhellach yn grwpiau coed, ac eto, ar gyfer pob clâd cellog, dewiswyd y genom sy'n cynnwys y nifer fwyaf o BGCs fel cynrychiolydd.Dadansoddwyd rhywogaethau a gyfoethogwyd gan BGC (o leiaf un genom gyda >15 BGCs) ymhellach trwy gyfrifo Mynegai Amrywiaeth Shannon ar gyfer y mathau o gynnyrch a amgodiwyd yn y BGCs hynny.Os yw'r holl fathau o gynnyrch a ragwelir yr un peth, ystyrir bod hybridau cemegol a BGCs cymhleth eraill (fel y rhagfynegir gan gwrth-SMAH) yn perthyn i'r un math o gynnyrch, waeth beth fo'u trefn yn y clwstwr (ee protein-bacteriocin a bacteriocin-proteoprotein fusion). corff).hybrid).
DNA sy'n weddill (amcangyfrifir ei fod yn 6 ng) o sampl Malaspina MP1648, sy'n cyfateb i sampl biolegol SAMN05421555 ac wedi'i baru â set darllen metagenomig Illumina SRR3962772 ar gyfer darlleniad byr, wedi'i brosesu yn unol â phrotocol dilyniannu PacBio gyda mewnbwn isel iawn i ddefnyddio pecyn PacBio SMRTbell gDNA sampl chwyddo cit (100-980-000) a phecyn paratoi templed SMRTbell Express 2.0 (100-938-900).Yn gryno, cafodd gweddill y DNA ei dorri, ei atgyweirio a'i buro (gleiniau ProNex) gan ddefnyddio Covaris (g-TUBE, 52104).Yna mae DNA wedi'i buro'n cael ei baratoi gan y llyfrgell, ei chwyddo, ei buro (gleiniau ProNex) a dewis maint (> 6 kb, Blue Pippin) cyn cam puro terfynol (gleiniau ProNex) a'i ddilyniannu ar lwyfan Sequel II.
Adluniad o'r ddau gyntaf ca.Ar gyfer MAG Eremiobacterota, fe wnaethom nodi chwe ANIs ychwanegol >99% (mae'r rhain wedi'u cynnwys yn Ffigur 3), a gafodd eu hidlo i ddechrau yn seiliedig ar sgoriau halogiad (a nodwyd yn ddiweddarach fel dyblygu genynnau, gweler isod).Gwelsom hefyd hambwrdd â'r label “Ca”.Eremiobacterota” o wahanol astudiaethau23 a’u defnyddio ynghyd ag wyth MAG o’n hastudiaeth fel cyfeiriad ar gyfer darlleniadau metagenomig o 633 o samplau wedi’u cyfoethogi ewcaryotig (>0.8 µm) gan ddefnyddio BWA (v.0.7.17) Cyf -r1188, – baner) i’w hailsamplu mapio (5 miliwn o ddarlleniadau).Yn seiliedig ar fapiau cyfoethogi-benodol (wedi'u hidlo gan hunaniaeth aliniad 95% a darllediad darllen 80%), dewiswyd 10 metagenom (y cwmpas disgwyliedig ≥5 ×) i'w cydosod a 49 metagenom ychwanegol (sylw disgwyliedig ≥1 ×) ar gyfer cydberthynas cynnwys.Gan ddefnyddio'r un paramedrau ag uchod, cafodd y samplau hyn eu binio ac ychwanegwyd 10 'Ca' ychwanegol.Mae MAG Eremiobacterota wedi'i adfer.Mae'r 16 MAG hyn (heb gyfrif y ddau sydd eisoes yn y gronfa ddata) yn dod â chyfanswm y genomau yn yr OMD estynedig i 34,815.Rhoddir rhengoedd tacsonomig i MAGs yn seiliedig ar eu tebygrwydd genomig a'u safle yn y GTDB.Cafodd 18 MAG eu hailadrodd gan ddefnyddio dRep i 5 rhywogaeth (ANI mewnbenodol >99%) a 3 genera (ANI mewngenerig 85% i 94%) o fewn yr un teulu79.Dewiswyd cynrychiolwyr rhywogaethau â llaw yn seiliedig ar gyfanrwydd, halogiad, a N50.Darperir y dull enwau a awgrymir yn y Wybodaeth Atodol.
Aseswch gyfanrwydd a halogiad 'Ca.MAG Eremiobacterota, fe wnaethom asesu presenoldeb uscMG, yn ogystal â setiau genynnau marcio copi sengl llinach a pharth-benodol a ddefnyddir gan CheckM ac Anvi'o.Cadarnhawyd adlunio 2 ddyblyg allan o 40 uscMG trwy ail-greu ffylogenetig (gweler isod) i ddiystyru unrhyw halogiad posibl (mae hyn yn cyfateb i 5% yn seiliedig ar y 40 genyn marcio hyn).Astudiaeth ychwanegol o bum MAG cynrychiadol 'Ca.Cadarnhawyd lefel isel yr halogion yn y genomau hyn wedi'u hail-greu ar gyfer rhywogaethau Eremiobacterota gan ddefnyddio'r rhyngwyneb Anvi'o rhyngweithiol yn seiliedig ar gydberthynas cyfansoddiad digonedd a dilyniant (Gwybodaeth Atodol)59.
Ar gyfer dadansoddiad ffylogenomig, dewiswyd pum MAG cynrychioliadol “Ca”.Eudormicrobiaceae", pob rhywogaeth "Ca.Mae genom Eremiobacterota ac aelodau o ffyla eraill (gan gynnwys UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria a Planctomycetota) ar gael gan GTDB (r89)13.Cafodd yr holl genomau hyn eu hanodi fel y disgrifiwyd yn flaenorol ar gyfer echdynnu genynnau marciwr copi sengl ac anodi BGC.Cadwyd y genomau GTDB yn unol â'r meini prawf cywirdeb a halogiad uchod.Perfformiwyd dadansoddiad ffylogenetig gan ddefnyddio llif gwaith Anvi'o Phylogenetics59.Adeiladwyd y goeden gan ddefnyddio IQTREE (v.2.0.3) (opsiynau diofyn a -bb 1000)80 ar aliniad o 39 o broteinau ribosomaidd tandem a nodwyd gan Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81.Gostyngwyd ei swyddi.i orchuddio o leiaf 50% o'r genom82 a defnyddiwyd Planctomycecota fel grŵp allanol yn seiliedig ar dopoleg coed GTDB.Adeiladwyd un goeden o 40 uscMG gan ddefnyddio'r un offer a pharamedrau.
Defnyddiwyd Traitar (adn.1.2) gyda pharamedrau rhagosodedig (ffenoteip, o niwcleotidau)83 i ragfynegi nodweddion microbaidd cyffredin.Fe wnaethom archwilio ffordd o fyw ysglyfaethus bosibl yn seiliedig ar fynegai ysglyfaethus a ddatblygwyd yn flaenorol84 sy'n dibynnu ar gynnwys genyn codio protein yn y genom.Yn benodol, rydym yn defnyddio DIAMOND i gymharu proteinau yn y genom yn erbyn cronfa ddata OrthoMCL (v.4)85 gan ddefnyddio'r opsiynau -mwy-sensitif -id 25 -ymholiad-cover 70 -corchudd-pwnc 70 -20 uchaf AC yn cyfrif y genynnau sy'n cyfateb i y genynnau marcio ar gyfer ysglyfaethwyr a'r rhai nad ydynt yn ysglyfaethwyr.Y mynegai yw'r gwahaniaeth rhwng nifer y marciau rheibus a'r rhai nad ydynt yn rheibus.Fel rheolaeth ychwanegol, fe wnaethom hefyd ddadansoddi'r genom “Ca”.Mae ffactor Entotheonella TSY118 yn seiliedig ar ei gysylltiad â Ca.Eudoremicrobium (maint genom mawr a photensial biosynthetig).Nesaf, fe wnaethon ni brofi cysylltiadau posibl rhwng genynnau marciwr ysglyfaethwr ac ysglyfaethwyr a photensial biosynthetig Ca.Eudormicrobiaceae” a chanfuwyd nad oes mwy nag un genyn (o unrhyw fath o enyn marcio, hy genyn ysglyfaethwr/nad yw'n ysglyfaethwr) yn gorgyffwrdd â BGC, gan awgrymu nad yw BGC yn drysu signalau ysglyfaethu.Perfformiwyd anodi genomig ychwanegol o atgynyrchiadau wedi'u sgramblo gan ddefnyddio TXSSCAN (v.1.0.2) i archwilio'r system secretion, pili, a flagella86 yn benodol.
Cafodd pum 'Ca' cynrychioliadol eu mapio trwy fapio 623 metadrawsgripsiwn o ffracsiynau cyfoethogi procaryotig ac ewcaryotig cefnforoedd Tara22,40,87 (gan ddefnyddio BWA, v.0.7.17-r1188, -a flag).Genom eudormicrobiaceae.Proseswyd ffeiliau BAM gyda FeatureCounts (v.2.0.1)88 ar ôl darllen 80% o sylw a 95% hidlo hunaniaeth (gydag opsiynau nodweddCounts - cynradd -O -ffracsiwn -t CDS, tRNA -F GTF -g ID -p ) Yn cyfrif y nifer y mewnosodiadau fesul genyn.Cafodd y mapiau a gynhyrchwyd eu normaleiddio ar gyfer hyd genynnau a nifer y genynnau marciwr mOTU (cyfrif mewnosod cyfartalog hyd-normaleiddio ar gyfer genynnau â chyfrif mewnosod> 0) a thrawsnewid log i 22.74 i gael y mynegiant cymharol fesul cell o bob lefel genyn, sydd hefyd yn esbonio'r amrywioldeb o'r sampl i'r sampl yn ystod y dilyniant.Mae cymarebau o'r fath yn caniatáu dadansoddiad cymharol, gan liniaru problemau cyfansoddiad wrth ddefnyddio data helaethrwydd cymharol.Dim ond samplau gyda >5 o'r genynnau marciwr 10 mOTU a gafodd eu hystyried ar gyfer dadansoddiad pellach i ganiatáu i gyfran ddigon mawr o'r genom gael ei chanfod.
Mae proffil trawsgrifio wedi'i normaleiddio o 'Ca.Roedd E. taraoceanii yn destun lleihad maint dimensiwn gan ddefnyddio UMAP a defnyddiwyd y cynrychioliad dilynol ar gyfer clystyru heb oruchwyliaeth gan ddefnyddio HDBSCAN (gweler uchod) i bennu statws mynegiant.Mae PERMANOVA yn profi arwyddocâd gwahaniaethau rhwng clystyrau a nodwyd yn y gofod pellter gwreiddiol (heb ei leihau).Profwyd mynegiant gwahaniaethol rhwng yr amodau hyn ar draws y genom (gweler uchod) a nodwyd 201 o lwybrau KEGG mewn 6 grŵp swyddogaethol, sef: BGC, system secretion a genynnau fflangellog o TXSSCAN, ensymau diraddio (proteas a pheptidasau), ac ysglyfaethus a heb fod yn. genadau rheibus.marcwyr mynegai rheibus.Ar gyfer pob sampl, fe wnaethom gyfrifo'r mynegiant normaleiddio canolrif ar gyfer pob dosbarth (sylwch fod mynegiant BGC ei hun yn cael ei gyfrifo fel mynegiant canolrif genynnau biosynthetig ar gyfer y BGC hwnnw) a'i brofi am arwyddocâd ar draws taleithiau (prawf Kruskal-Wallis wedi'i addasu ar gyfer FDR).
Prynwyd genynnau synthetig o GenScript a phrynwyd paent preimio PCR gan Microsynth.Defnyddiwyd Phusion polymeras o Thermo Fisher Scientific ar gyfer mwyhau DNA.Defnyddiwyd plasmidau NucleoSpin, gel NucleoSpin a phecyn puro PCR o Macherey-Nagel ar gyfer puro DNA.Prynwyd ensymau cyfyngu a ligas DNA T4 o New England Biolabs.Prynwyd cemegau heblaw isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Biosynth) a 1,4-dithiothreitol (DTT, AppliChem) gan Sigma-Aldrich a'u defnyddio heb eu puro ymhellach.Prynwyd y gwrthfiotigau cloramphenicol (Cm), spectinomycin dihydrochloride (Sm), ampicillin (Amp), gentamicin (Gt), a charbenicillin (Cbn) gan AppliChem.Prynwyd cydrannau cyfryngau Bacto Tryptone a Bacto Yeast Extract gan BD Biosciences.Prynwyd Trypsin ar gyfer dilyniannu gan Promega.
Echdynnwyd dilyniannau genynnau o BGC 75.1 rhagfynegedig gwrth-SMASH.E. malaspinii (Gwybodaeth atodol).
Mae'r genynnau embA (locws, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (locws, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4), ac embAM (gan gynnwys rhanbarthau rhynggenaidd) wedi'u optimeiddio fel lluniadau synthetig pR57 mewn dilyniant mewn codiadau RUC amp E5 mewn mynegiant pryd.Cafodd y genyn embA ei is-glonio i safle clonio lluosog cyntaf (MCS1) pACYCDuet-1(CmR) a pCDFDuet-1(SmR) gyda safleoedd holltiad BamHI a HindIII.Cafodd y genynnau embM ac embMopt (codon-optimized) eu his-glonio i MCS1 pCDFDuet-1 (SmR) gyda BamHI a HindIII a'u gosod yn yr ail safle clonio lluosog pCDFDuet-1 (SmR) a pRSFDuet-1 (KanR) (MCS2) gyda NdeI/ChoI.Cafodd casét embAM ei is-glocio i pCDFDuet1(SmR) gyda safleoedd holltiad BamHI a HindIII.Adeiladwyd y genyn orf3/embI (locws, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffald_127-gene_3) gan estyniad gorgyffwrdd PCR gan ddefnyddio preimwyr EmbI_OE_F_NdeI ac EmbI_OE_R_XhoI, wedi'i dreulio gyda NdeI/XhoI, a'i glymu i mewn i'r un cyfyngiad p-127-ensym (DFMs) (c-127-gene) a'i glymu i mewn i'r un cyfyngiad p-1C-1 atodol bwrdd).6).Perfformiwyd treuliad ensymau cyfyngu a ligation yn unol â phrotocol y gwneuthurwr (New England Biolabs).