310 10 * 1mm Cydran gemegol tiwbiau torchog dur di-staen, Mae parthau terfynell N o spidroin yn ffurfio hydrogeliau yn seiliedig ar ffibrilau amyloid ac yn darparu llwyfan ar gyfer ansymudiad protein.

Diolch am ymweld â Nature.com.Rydych chi'n defnyddio fersiwn porwr gyda chefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn ogystal, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, rydym yn dangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Sliders yn dangos tair erthygl fesul sleid.Defnyddiwch y botymau cefn a nesaf i symud trwy'r sleidiau, neu'r botymau rheolydd sleidiau ar y diwedd i symud trwy bob sleid.

Manyleb

310 10*1mm Cyflenwyr tiwbiau torchog dur di-staen

Cyfansoddiad Cemegol

Priodweddau Mecanyddol

Mae gan broteinau sidan pry cop ailgyfunol (proteinau sidan pry cop) lawer o gymwysiadau posibl wrth ddatblygu bioddeunyddiau newydd, ond mae eu natur amlfodd ac sy'n dueddol o agregu yn eu gwneud yn anodd eu cael ac yn hawdd eu defnyddio.Yma rydym yn adrodd bod proteinau spidroin bach ailgyfunol ac, yn bwysig, y parth N-terminal (NT) ei hun yn gyflym yn ffurfio hydrogeliau hunangynhaliol a thryloyw ar 37 ° C.mae proteinau ymasiad sy'n cynnwys NT a phrotein fflwroleuol gwyrdd neu ffosfforylase niwcleosid purin yn ffurfio proteinau ymasiad cwbl weithredol.Hydrogels.Mae ein canlyniadau'n dangos bod proteinau NT ac ymasiad ailgyfunol yn darparu cynnyrch mynegiant uchel a hydrogeliau gwaddol gyda phriodweddau deniadol fel tryloywder, gelation heb groesgysylltu, ac atal symud proteinau gweithredol ar ddwysedd uchel yn uniongyrchol.
Mae gan gorynnod gynifer â saith set wahanol o chwarennau sidan, pob un yn cynhyrchu math penodol o sidan.Mae pob un o'r saith rhywogaeth sidan yn cynnwys proteinau sidan pry cop (spidroins) tua 6000 o weddillion o hyd ac maent yn cynnwys rhanbarth ailadrodd canolog mawr wedi'i amgylchynu gan barthau terfynell N- a C sfferig (NT a CT)1,2.Mae'r math o sidan a astudiwyd fwyaf, yr ampwla cynradd, yn cael ei gynhyrchu gan y chwarren ampwla cynradd.Yn y chwarren hon, mae monolayer o gelloedd epithelial yn syntheseiddio proteinau spidroin ac yn eu secretu i lwmen y chwarren, lle maent yn bresennol mewn ffurf hydawdd (dopio) ar grynodiadau uchel iawn (30-50% w/v)3,4.Mae trefniadaeth a chydffurfiad y prif broteinau spidroin ampulular yn y chwarren wedi'u trafod, ond mae'r rhan fwyaf o dystiolaeth arbrofol yn nodi presenoldeb cydffurfiad helical helical a/neu hap yn gyffredinol a strwythurau micellar neu lamellar5,6,7,8,9,10.Er bod y parthau ailadroddus yn rheoleiddio priodweddau mecanyddol ffibrau sidan, gan ffurfio nanocrystalau β-dalen a strwythurau amorffaidd11,12,13,14,15, mae parthau diwedd yn rheoleiddio ffibrau sidan mewn ymateb i amodau newidiol ar hyd y chwarren sidan16,17,18.Trwy reoli ffurfiant sidan, 19. Mae parthau terfynell yn cael eu cadw'n esblygiadol a gall eu swyddogaeth fod yn gyffredin i bob protein spidroin 2,20,21.Wrth fynd trwy'r chwarren, mae pH spidroin yn gostwng o tua 7.6 i <5.716 ac yn cynyddu gyda chneifio ac ymestyn wedi'i gyfryngu gan symudiad trwy'r ddwythell sy'n culhau'n raddol.Mewn datrysiad, mae CT yn dimer17 cyfochrog cyfansoddiadol α-helical, ond mewn ymateb i pH isel a grymoedd cneifio, mae CT yn datblygu ac yn switshis β-haenau16, 17, gan sbarduno o bosibl haenau β yn y rhanbarthau ailadroddus o Convert 16. Mae NT yn monomerig o dan amodau sy'n adlewyrchu amodau yn lwmen y chwarren ac yn cyfryngu hydoddedd spidroin, ond ar pH is, mae protoneiddio nifer o gadwynau ochr asid carbocsilig yn arwain at bylu NT gyda pKa o tua 6.5, a thrwy hynny sefydlogi NT a gosod spidroin yn fawr meintiau.rhwydweithiau16,18.Felly, mae NT yn chwarae rhan allweddol mewn ffurfio ffilament, gan newid o fonomer yn y cotio i dimer yn y ffibr23,24,25.Mae NT yn parhau i fod yn hydawdd iawn ac yn helical o dan yr holl amodau a astudiwyd hyd yma16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, a ysbrydolodd ei ddatblygiad fel label sy'n gwella hydoddedd ar gyfer cynhyrchu proteinau heterologaidd.
Mae protein sidan pry cop bach ailgyfunol, sy'n cynnwys un NT, un rhanbarth ailadrodd byr, un CT, a thag His6 (His-NT2RepCT) ar gyfer puro, yr un mor hydawdd mewn byffer dyfrllyd â phrotein sidan pry cop brodorol ac yn dynwared nodweddion pwysig brodorol pry cop sidan .sylw 25.31.Gellir troi ei-NT2RepCT yn ffibrau parhaus gan ddefnyddio peiriant biomimetig lle mae gorchudd hydawdd pH 8 yn cael ei allwthio i faddon dŵr pH 525,32,33,34,35.Arweiniodd eplesiad bio-adweithydd o E. coli gan fynegi Ei-NT2RepCT ac ôl-driniaeth ddilynol at gynnyrch >14 g/L ar ôl puro.Mae cynnyrch uchel, hydoddedd uchel, ac ymateb digonol His-NT2RepCT i gyflyrau asidig i gyd yn cael eu priodoli i NT23, 25, 34.
Yma rydym yn adrodd am ffurfio cyflym hydrogeliau tryloyw o broteinau spidroin ailgyfunol, gan gynnwys NT yn unig, trwy ddeor hydoddiant protein ar 37 ° C.Gan ddefnyddio fflworoleuedd thioflavin T (ThT), mae Fourier yn trawsnewid sbectrosgopeg isgoch (FTIR), sbectrosgopeg cyseiniant magnetig niwclear (NMR) a microsgopeg electronau trawsyrru (TEM), canfuom fod proteinau NT a microspider yn cael eu trawsnewid yn strwythurol yn ddalennau β a ffibrilau tebyg i amyloid pan fydd geliau'n cael eu ffurfio.Yn ogystal, mae proteinau ymasiad o NT a phrotein fflwroleuol gwyrdd (GFP) neu ffosfforylase niwcleosid purine (PNP) yn ffurfio hydrogeliau gyda darnau ymasiad cwbl weithredol.Mae mynegiant trwybwn uchel mewn gwesteiwyr heterologaidd, ynghyd â ffurfiant cyflym o hydrogeliau o dan amodau ffisiolegol, yn agor y posibilrwydd o gynhyrchu hydrogeliau gyda swyddogaethau peirianyddol yn gost-effeithiol.
Yn wahanol i’r rhan fwyaf o broteinau spidroin ailgyfunol yr adroddir amdanynt36, mae His-NT2RepCT yn sefydlog mewn byffer Tris-HCl ar pH 8 a gellir ei grynhoi hyd at 500 mg/mL heb wlybaniaeth25.Felly, cawsom ein synnu o ddarganfod bod y protein hwn yn ffurfio hydrogeliau hunangynhaliol sy'n glir yn optegol yn gyflym wrth ddeor ar 37 ° C (Ffig. 1b-d).Dangosodd astudiaethau pellach fod gelation Ei-NT2RepCT wedi digwydd dros ystod eang o grynodiadau protein (10-300 mg / ml) a bod y crynodiad hwn yn cydberthyn yn wrthdro ag amser gelation (Ffig. 1c a Ffig Atodol. 1).I ddarganfod pa rannau o His-NT2RepCT sy'n cyfryngu ffurfiant hydrogel, fe wnaethom wedyn archwilio pob parth yn unigol ac mewn cyfuniadau amrywiol gan ddefnyddio assay gwrthdroad fflasg (Ffigur 1a,b).Roedd yr holl ffracsiynau a brofwyd o spidroin ailgyfunol yn ffurfio geliau (ar grynodiad protein o 300 mg/mL) mewn llai nag 1 h, ac eithrio 2 Rep gwaddodol (Ffig. 1b).Mae hyn yn awgrymu y gall NT a CT yn unig, ar y cyd, neu'n gysylltiedig ag ailddarllediadau, gelu ar 37°C ac nad yw'r tag His6 yn effeithio ar y broses hon i unrhyw raddau arwyddocaol.O ystyried y syniad cyffredin bod NT yn brotein hydawdd a sefydlog iawn, a bod adroddiadau blaenorol o hydrogeliau spidroin ailgyfunol wedi priodoli effeithiau gelation i newidiadau cydffurfiad mewn rhanbarthau ailadroddus a/neu CTs, gallai NT ei hun.Roedd darganfod gelation yn annisgwyl.Tabl Atodol 1) 37, 38, 39. Yn rhyfeddol, mae NT eisoes wedi'i gellio o fewn 10 munud ar grynodiad o ≥ 300 mg/mL (Ffig. 1c).Dangosodd arbrofion gwrthdroad ffiol gyda chrynodiadau amrywiol o NT, ar >50 mg/ml, fod yr hydoddiant NT wedi gelu'n gyflymach na His-NT2RepCT ar y crynodiad cyfatebol (w/v, Ffigur 1c).
Cynrychioliad sgematig o wahanol luniadau spidroin a astudiwyd yn y gwaith hwn.b Amser gel ar 37 ° C ar gyfer gwahanol broteinau spidroin ailgyfunol (300 mg / mL) wedi'u gwirio trwy wrthdroi'r ffiol.Gel CT ar unwaith heb ddeor (<300 mg/mL), gwaddod 2Rep (300 mg/mL, graddfa 5 mm).c Amser gel ei-NT2RepCT ac NT ar grynodiadau protein a nodir ar 37°C.ch Ffotograffau o hydrogeliau His-NT2RepCT ac NT gyda'r pry cop a'r llythyren “NT” wedi'u hargraffu oddi tanynt, yn y drefn honno (y ddau yn 200 mg/mL, bar graddfa 5 mm).
Mae gan hydrogeliau a ffurfiwyd gan broteinau spidroin ailgyfunol amrywiol liwiau ychydig yn wahanol, ac mae arsylwi llygad noeth yn dangos graddau amrywiol o dryloywder (Ffig. 1b).Mae geliau NT yn eithriadol o glir tra bod geliau eraill yn mynd yn afloyw.Gallai geliau ei-NT2RepCT ac NT sy'n cael eu bwrw i mewn i diwbiau silindrog gael eu tynnu o'r mowld yn gyfan (Ffig. 1d).
Er mwyn profi a yw gorchuddion sidan pry cop naturiol yn gel o dan amodau y canfuwyd eu bod bellach yn achosi gelation o'r proteinau spidroin ailgyfunol, casglwyd haenau o chwarren ampulla fawr y pry cop pont Sweden (Larinioides sclopetarius).Cafodd haenau eu storio mewn byffer Tris-HCl 20 mM ar 50 mg/mL (yn seiliedig ar bwysau sych a fesurwyd), ond ni welwyd unrhyw gelation yn ystod y cyfnod magu 21 diwrnod ar 37 °C (Ffigur Atodol 2a).
I feintioli'r geliau hyn, gellir defnyddio mesuriadau rheolegol i astudio'r broses gelation a phennu'r priodweddau mecanyddol cyffredinol.Yn benodol, gall monitro'r modwlws storio (elastigedd) ar dymheredd uchel ddarparu gwybodaeth am y tymheredd gellio yn ogystal â phriodweddau viscoelastig y cotio.Dangosodd arbrofion codiad tymheredd (gan ddefnyddio 1°C/min ar 25-45°C, yn seiliedig ar astudiaethau blaenorol yn defnyddio hydoddiannau stoc sidan naturiol)40,41 fod modwli storio hydoddiannau His-NT2RepCT ac NT wedi cynyddu gyda thymheredd cynyddol .ei gynyddu (Ffig. 2 a Atodol Ffig. 3).Yn nodedig, dechreuodd y modiwl NT dyfu ar dymheredd is o'i gymharu â His-NT2RepCT, yn gyson â'r amser gel cyflymach a welwyd pan gafodd NT ei ddeori'n uniongyrchol â His-NT2RepCT ar 37 ° C (Ffigur 1).Ar ôl gostyngiad dilynol mewn tymheredd, ni ddychwelodd y modwlws storio i werthoedd is ac arhosodd yn uwch na'r modwlws colled (gweler Ffig Atodol 3), gan nodi gelation sefydlog thermol anwrthdroadwy.Ar ôl gelation, roedd y modwlws elastig terfynol yn amrywio o 15 i 330 kPa ar gyfer hydrogeliau His-NT2RepCT mewn crynodiad o 100–500 mg/mL, ac roedd y modwlws elastig terfynol ar gyfer hydrogeliau NT (100–500 mg/mL) yn amrywio o 2 i 1400 kPa (Ffig. , 2 a data ramp cyflawn) gweler Ffig Atodol 3).
a Newid yn y tymheredd yn ystod mesuriadau Ei-NT2RepCT (300 mg/mL) a b NT (300 mg/mL) gydag ysgwyd.Mae'r saethau'n nodi'r duedd tymheredd, ac mae cysgodi ysgafnach y data modiwl storio yn dangos profion ar werthoedd torque is ar gyfer yr offeryn nag a bennir gan y gwneuthurwr, sef achos y sŵn cynyddol.c Croniad modiwl diwedd o His-NT2RepCT ac NT ar ôl tymheredd uchel (100, 300, a 500 mg/mL).Mae pob darlleniad modiwl yn cael ei gymryd ar amledd o 0.1 Hz.
Fel dull posibl ar gyfer ymchwilio i newidiadau cydffurfiad sy'n gysylltiedig â gelation, fe wnaethom gofnodi sbectra FTIR o His-NT2RepCT ac NT cyn ac ar ôl gelation ar 37 ° C (Ffigur 3a,b).Yn ôl y disgwyl, roedd sbectra hydoddiannau His-NT2RepCT ac NT yn cyfateb i broteinau yn dangos adeiledd eilaidd α-helix/coil ar hap, gyda band amlwg yn 1645 cm-1.Ar gyfer y ddau hydrogel, arweiniodd gelation at ffurfio dwy fraich yn y band I canol tua 1617 cm-1 a 1695 cm-1 (Ffig. 3a, b), sy'n nodi ffurfio strwythurau gwrthgyfochrog β-dalen.Gellir gweld y newidiadau hyn yn glir hefyd yn yr ail ddeilliad priodol a'r sbectra gelation gwahaniaeth (Ffig Atodol 4b).Roedd dau fand yr haen β NT yn fwy amlwg na rhai His-NT2RepCT, gan ddangos bod cyfanswm cynnwys y bandiau β-haen yn yr hydrogel NT yn uwch na'r hydrogel NT2RepCT.
sbectra amsugno FTIR o His-NT2RepCT a b NT (y ddau 500 mg/mL) cyn (hydoddiant) ac ar ôl deoriad (gel) ar 37°C.c Delweddau TEM o geliau NT2RepCT 50 mg/ml wedi'u hailddarlledu a d NT.Bar graddfa 200 nm.e Diamedrau ffibr o hydrogeliau Ei-NT2RepCT ac NT.n = 100 ffibrilau wedi'u mesur, p < 0.0001.Mae'r bariau gwall yn dangos y gwyriad safonol.Canol y bariau gwall yw'r cymedr.Defnyddiwyd prawf-t heb ei baru (dwy gynffon) ar gyfer dadansoddiad ystadegol.f ThT fflworoleuedd gwahanol broteinau spidroin ailgyfunol (100 mg/mL) ar 37 ° C heb ysgwyd.g Arbrofion brechu NT (100 mg/mL) o gel NT 100 mg/mL gyda hadau 0%, 5%, 10% ac 20%.
Dangosodd dadansoddiad o'r gel gan ddefnyddio microsgopeg electron trawsyrru (TEM) fod yr hydrogel yn cynnwys ffibrilau tebyg i amyloid (Ffig. 3c, 3d).Roedd ffibrilau a ffurfiwyd gan YG yn hirfain (5-12 nm mewn diamedr) ac yn ddi-ganghennau, tra bod ffibrilau Ei-NT2RepCT yn fyrrach o ran hyd ac yn sylweddol ehangach mewn diamedr (7-16 nm) (Ffig. 3e).Roedd y canlyniadau hyn yn ein galluogi i ddilyn cineteg ffibrosis gan ddefnyddio'r assay T thioflavin T (ThT).Ar gyfer yr holl broteinau spidroin ailgyfunol, cynyddodd y signal fflwroleuol pan ddeorwyd samplau ar 37 ° C (Ffig. 3f, Ffig Atodol 5a).Yn gyson â'r canfyddiad hwn, datgelodd archwiliad microsgopig o NT a His-NT2RepCT o dan amodau gelling gynnydd unffurf mewn fflworoleuedd ThT heb groniad lleol amlwg o agregau ThT-positif (Ffig Atodol 5b,c).Nid oedd cynnydd mewn cymylogrwydd NT a Ei-NTCT (Ffig Atodol 5d) yn cyd-fynd â ffurfio ffibrilau ThT-positif, sy'n golygu y gallai rhwydwaith o ffibrilau yn y gel ffurfio heb beryglu eglurder gel.Gall hadu trwy ychwanegu symiau bach o ffibrilau wedi'u ffurfio ymlaen llaw gyflymu ffurfiant ffibril rhai amyloidau42,43,44 yn sylweddol ond gan ychwanegu 5%, 10% neu 20% (w/w) NT at hydoddiant o hydrogeulyddion YG.effaith hadu (Ffig. 3g).Efallai bod hyn oherwydd y ffaith bod y ffibrilau yn yr hydrogel yn gymharol sefydlog ac ni ellir eu defnyddio fel hadau.
Arweiniodd ymddygiad annisgwyl proteinau spidroin ailgyfunol ar dymheredd uchel at astudiaethau sbectrosgopeg cyseiniant magnetig niwclear (NMR) pellach i nodi newidiadau cydffurfiad sy'n gysylltiedig â ffurfio gel.Roedd sbectra NMR o atebion His-NT2RepCT a gofnodwyd dros amser ar 37°C yn dangos bod CT yn dal i gael ei blygu'n rhannol, tra bod signalau NT a 2Rep wedi diflannu (Ffig. 4a), sy'n awgrymu mai NT a 2Rep yn bennaf oedd yn rheoli'n rhannol ffurfiant His- hydrogel NT2RepCT.Gwanhawyd y signal CT hefyd i 20% o'i ddwysedd gwreiddiol, sy'n awgrymu bod CT hefyd yn bennaf wedi'i osod a'i ymgorffori yn y strwythur hydrogel.Ar gyfer cyfran lai o'r CT, sydd yr un mor symudol ag yn y sampl wedi'i rhag-deori ac a welwyd felly gan ateb NMR, mae diffyg signalau yn y sbectra ar gyfer y 10 gweddillion strwythuredig cyntaf, o bosibl oherwydd ansymudiad anodd o'r gyfran atodedig o His-NT2Rep .Datgelodd sbectra NMR cyflwr hydrogeliau -NT2RepCT bresenoldeb pennaf α-helices a β-haenau ac, i raddau llai, y cydffurfiad coil ar hap (Ffig. 4b).Dangosodd dadansoddiad sifft cemegol o weddillion methionin a oedd yn bresennol yn NT yn unig fod y parth hwn wedi'i drawsnewid yn strwythur β-sheet.Dangosodd sbectra amser-ddibynnol NT mewn hydoddiant ostyngiad unffurf mewn dwyster signal (Ffig. 4c), a dangosodd NMR cyflwr solet o hydrogeliau NT fod y rhan fwyaf o'r gweddillion NT yn cael eu trosi i strwythurau β-ddalen (Ffig. 4d).Ni ellid pennu cydffurfiad 2Rep ar wahân oherwydd ei duedd i agregu.Fodd bynnag, roedd sbectra cyflwr solet NMR yr hydrogeliau NTCT a His-NT2RepCT yn edrych yn debyg iawn (Ffig. 4b; Ffig. Atodol 6b), gan awgrymu nad oedd 2Rep yn cyfrannu fawr ddim at ran adeileddol yr hydrogel His-NT2RepCT.Ar gyfer hydrogeliau CT, canfuwyd bod α-helices, β-sheets, a strwythurau eilaidd helical ar hap yn bodoli (Ffig Atodol. 6d).Mae hyn yn awgrymu bod rhai rhannau o'r CT yn aros yn α-helices tra bod eraill yn dod yn β-sheets.Felly, mae canlyniadau sbectrosgopeg NMR yn awgrymu bod NT yn bwysig ar gyfer ffurfio hydrogel a hefyd yn trawsnewid yn gydffurfiad β-dalen wrth ymasiad â 2Rep a CT.Yn gyson â hyn, canfuwyd yn ddiweddar bod zippers gofodol amyloid yn debygol o ffurfio ym mhob un o'r pum helices o'r parth NT, ac roedd algorithm Waltz yn rhagweld rhanbarth amyloidogenig yn helix 1 (Ffig. 4e).
Sbectra 2D o 15N-HSQC 10 mg/mL Hydoddiant ei-NT2RepCT cyn (glas) a 19 awr ar ôl deor (coch) ar 37°C.Mae copaon croes unigol yn y sbectrwm coch ac F24, G136, polyA yn y sbectrwm glas yn cael eu dynodi gan symbolau asid amino un llythyren a rhifau gweddillion.Mae'r mewnosodiadau yn dangos dibyniaeth dwyster y signal ar amser ar gyfer gweddillion dethol o'r parthau NT, 2Rep, a CT.b sbectra radio-amledd cyflwr solid (RFDR) o hydrogeliau His-NT2RepCT.Pennwyd cydberthnasau gweddillion Cα/Cβ a welwyd mewn sbectra RFDR trwy gymharu â sifftiau cemegol peptid model a gwerthoedd sy'n deillio o ystadegau82,83 a'u strwythurau eilaidd.SSB – band ochr sy'n cylchdroi.c Sbectra un dimensiwn o hydoddiant NT 15N-HSQC 10 mg/mL yn ystod cyfnod deori ar 37 ° C am 36 awr.Mae'r mewnosodiad yn dangos dwyster cyfeintiol yn erbyn amser.d Sbectra RFDR cyflwr solet o hydrogeliau NT.Nodir y cydberthynas rhwng gweddillion Cα/Cβ a'u strwythurau eilaidd a welwyd yn y sbectra RFDR.e Yn seiliedig ar broffil tueddiad ffibriliad NT45.79 o gronfa ddata Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Dangosir egni Rosetta ffenestr sifft mellt ofodol yr hecsapeptid mewn kcal/mol.Mae bariau coch yn dynodi hecsapeptidau â thuedd ffibrosis uchel (egni Rosetta o dan -23 kcal/mol; o dan y llinell ddotiog).Mae bariau gwyrdd yn dynodi darnau gydag egni Rosetta uwchlaw'r trothwy ac felly'n llai tebygol o ffurfio zippers steric.Cafodd darnau sy'n cynnwys proline eu heithrio o'r dadansoddiad (heb golofnau).Mae sgwariau'n nodi ardaloedd o amyloidosis a ragfynegwyd gan algorithm Waltz81 ( https://waltz.switchlab.org ).Mae dilyniant gweddillion asid amino NT ar y brig, a dangosir y mathau o weddillion a geir yn y strwythur eilaidd β (a bennir gan sbectrosgopeg cyflwr solet NMR) mewn coch.Mae safleoedd y pum helice α NT wedi'u dynodi fel (H1-H5)28.
Ar pH <6.5, mae HT yn pylu, gan ei fod yn gallu gwrthsefyll dadnatureiddiad a achosir gan wres neu wrea18.Er mwyn egluro sut mae pylu NT a sefydlogrwydd yn effeithio ar gelation, rheolwyd hydoddiannau sy'n cynnwys 100 mg/ml NT ar pH 8, 7, a 6 gan ddefnyddio'r prawf gwrthdroad ffiol.Deorwyd samplau NT ar pH 8 a 7 gelled ar ôl 30 munud ar 37 °C, ond arhosodd y gel pH 8 yn glir, tra bod y gel pH 7 yn dangos gwaddod gweladwy (Ffig. 5a).Mewn cyferbyniad, nid oedd hydoddiant sy'n cynnwys HT ar pH 6 yn ffurfio gel, a gellid gweld gwaddod mawr ar ôl 20 munud ar 37 ° C.Mae hyn yn awgrymu bod pylu eu hunain a/neu eu sefydlogrwydd uwch o gymharu â monomerau yn atal gelation.Ni ddisgwylir ffurfio gwaddod ar gyfer NT ar pH 7 a 6, oherwydd dywedwyd bod NT yn hydawdd ar 200 mg/ml27, yn ail-blygu'n hawdd ar ôl dadnatureiddio gwres, a hefyd yn cadw α-helix ar werthoedd is o pH 18. Eglurhad tebygol am yr anghysondebau hyn yw bod yr arbrofion a adroddwyd yn flaenorol wedi'u cynnal ar dymheredd ystafell neu'n is, neu ar grynodiadau protein cymharol isel16,18,19.
Prawf gwrthdroad ffiol NT (100 mg/mL) ar pH 8, 7, 6 a 154 mM NaCl (pH 8) ar ôl deori ar 37 ° C.b sbectra CD NT gyda a heb 154 mM NaF a 154 mM NaCl, yn y drefn honno.Trosir eliptigedd molar ar 222 nm i gyfran o blygiadau naturiol.c Assay gwrthdroad NT (100 mg/mL) NT* (37 °C a 60 °C), NTA72R (37 °C), a His-NT-L6 (37 °C a 60 °C).d sbectra CD o mutants NT NT*, NTA72R, a His-NT-L6.Trosir eliptigedd molar ar 222 nm i gyfran o blygiadau naturiol.e Prawf gwrthdroad o NTFlSp, NTMiSp ac NTMiSp gostyngol (100 mg/mL).Bar graddfa 5 mm.f sbectra CD o NT, NTFlSp, NTMiSp a llai o NTMiSp.Trosir eliptigedd molar ar 222 nm i gyfran o blygiadau naturiol.Dangosir sbectra NT llawn ar 25 °C a 95 °C yn Ffigur Atodol 8.
Mae crynodiad halen ffisiolegol yn pennu rhyngweithiadau electrostatig rhwng is-unedau NT a lleihau'r broses o drosglwyddo NT i pH18 is.Canfuom fod presenoldeb 154 mM NaCl a NaF yn wir yn atal gelation, yn y drefn honno (Ffig. 5a, b; Atodol Ffig. 2b) a bod halwynau hyn yn cynyddu sefydlogrwydd thermol monomerau NT (Ffig. 5b, Atodol Ffig. 8) .Mae hefyd yn awgrymu bod gwella sefydlogrwydd, yn hytrach na dimerization, yn atal ffurfio gel.
Er mwyn archwilio ymhellach rôl pylu protein a sefydlogrwydd mewn gelation, defnyddiwyd dau mutants, NT* a NTA72R, sydd hefyd yn parhau i fod yn fonomerig ar pH28.30 isel.Mutant gwrthdroad gwefr ddwbl yw NT* lle mae dosbarthiad gwefr deubegynol ymddangosiadol y monomer yn cael ei wastatau, sy'n atal pylu ac yn cynyddu sefydlogrwydd monomer yn sylweddol.Mae NTA72R yn deupol wedi'i gyhuddo, ond mae Ala a amnewidiwyd gan Arg wedi'i leoli ar y ffin dimer, felly mae treigladau'n ymyrryd â rhyngweithiadau is-uned sydd eu hangen ar gyfer pylu.Ar ôl deori ar 37 ° C, ni ffurfiodd NT* hydrogel, tra bod NTA72R yn ffurfio gel afloyw am 15 munud (Ffig. 5c).Gan na all NT* ac NTA72R wanhau ond eu bod yn gwahaniaethu o ran sefydlogrwydd monomer (Ffig. 5d), mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu'n gryf bod sefydlogrwydd thermodynamig uchel yn atal YG rhag gelio.Ategir hyn hefyd gan y ffaith bod HT* yn ffurfio gel pan fo'n ansefydlog ar dymheredd uchel (ar ôl 8 munud ar 60°C; Ffig. 5c).Dangoswyd yn flaenorol bod cynnwys uchel methionin yn NT yn hylifo ei blygu naturiol a bod chwe amnewidyn Met i Leu (y cyfeirir ato yma fel His-NT-L6) yn sefydlogi'r monomer NT46 yn gryf.Yn seiliedig ar y rhagdybiaeth bod angen hyblygrwydd strwythurol ar gyfer ffurfio gel NT, canfuom nad oedd y mutant sefydlog His-NT-L6 yn gelu ar 37 ° C (Ffigur 5c, d).Fodd bynnag, ffurfiodd His-NT-L6 gel hefyd wrth ddeori ar 60 ° C am 60 munud (Ffig. 5c).
Ymddengys bod gallu NT i drawsnewid yn strwythurau β-dalen a ffurfio hydrogeliau yn berthnasol i rai ond nid pob un o'r parthau NT o spidroin.Ffurfiodd NTs o wahanol fathau o sidan a rhywogaethau pry cop, Trichonepila clavipes (NTFlSp), geliau er gwaethaf eu cynnwys methionin cymharol isel a sefydlogrwydd thermol uchel (Ffig. 5e, f a Thabl Atodol 2).Mewn cyferbyniad, nid oedd NT o'r spidroin protein ampulular bach o Araneus ventricosus (NTMiSp) â sefydlogrwydd thermol isel a chynnwys methionin uchel yn ffurfio hydrogeliau (Tabl Atodol 2 a Ffig. 5e, f).Gall yr olaf fod yn gysylltiedig â phresenoldeb bondiau disulfide intramoleciwlaidd29,47.Yn gyson, pan gafodd bondiau disulfide NTMiSp eu lleihau, ffurfiodd hydrogel ar ôl deoriad ar 37 ° C am 10 munud (Ffig. 5e).I gloi, dylid nodi bod hyblygrwydd strwythurol yn faen prawf pwysig, ond nid yr unig un, ar gyfer ffurfio gel o NT.Ffactor arall a allai fod yn berthnasol yw'r duedd i ffurfio ffibrilau amyloid, a dangosodd dadansoddiad gyda'r gronfa ddata zipper ac algorithm Waltz gydberthynas rhwng y gallu i ffurfio geliau a phresenoldeb rhanbarthau amyloidogenig, yn ogystal â graddau'r rhanbarthau a ragwelwyd. i ffurfio zippers steric.Roedd cydberthynas (Tabl Atodol 2 a Ffig. Atodol 9).
Arweiniodd gallu NT i ffurfio ffibrilau a ffurfio geliau o dan amodau ffafriol i ni ddamcaniaethu y gall ymasiadau NT â darnau eraill o brotein ddal i ffurfio geliau gyda swyddogaeth lawn partneriaid ymasiad.I brofi hyn, fe wnaethom gyflwyno protein fflwroleuol gwyrdd (GFP) a phosphorylase niwcleosid purine (PNP) yn C-terminus yr YG, yn y drefn honno.Mynegwyd y proteinau ymasiad canlyniadol yn E. coli gyda chynnyrch terfynol uchel iawn (diwylliannau fflasg ysgwyd 150 mg/L a 256 mg/L ar gyfer His-NT-GFP a His-NT-PNP, yn y drefn honno), yn gyson â'r hyn a ddangoswyd ar gyfer proteinau eraill wedi'u hasio i NT Cyf.30. Ffurfiodd proteinau ymasiad His-NT-GFP (300mg/mL) a His-NT-PNP (100mg/mL) geliau ar ôl 2 awr a 6.5 awr ar 37°C ac, yn bwysig iawn, arhosodd y ffracsiwn GFP heb ei newid.arsylwyd ar ôl gelation, gyda >70% o'r dwyster fflworoleuedd cychwynnol yn weddill ar ôl gelation (Ffig. 6a).Er mwyn mesur gweithgaredd PNP yn ei atebion a geliau-NT-PNP, bu'n rhaid i ni wanhau'r protein ymasiad ag NT oherwydd bod gweithgaredd enzymatig y paratoad pur y tu allan i ystod canfod y assay ar grynodiadau gelling.Roedd y gel a ffurfiwyd gyda chymysgedd sy'n cynnwys 0.01 mg/mL His-NT-PNP a 100 mg/ml NT yn cadw 65% o weithgaredd enzymatig cychwynnol y samplau cyn-deor (Ffig. 6b).Arhosodd y gel yn gyfan yn ystod y mesuriad (Ffig Atodol 10).
Dwysedd fflworoleuedd cymharol cyn ac ar ôl gelu His-NT-GFP (300 mg/mL) a ffiol gwrthdro sy'n cynnwys hydrogel His-NT-GFP (300 mg/mL) o dan olau gweladwy ac UV.Mae pwyntiau'n dangos mesuriadau unigol (n = 3), bariau gwall yn dangos gwyriad safonol.Dangosir y gwerth cyfartalog yng nghanol y bariau gwall.b Cafwyd gweithgaredd PNP trwy ddadansoddiad fflworometrig gan ddefnyddio hydoddiannau a geliau yn cynnwys NT (100 mg/ml) a chymysgedd yn cynnwys 0.01 mg/ml ei-NT-PNP a 100 mg/ml o ddoleri Taiwan Newydd.Mae'r mewnosodiad yn dangos ffiol wrthdro sy'n cynnwys hydrogel sy'n cynnwys His-NT-PNP (bar graddfa 5 mm).
Yma, rydym yn adrodd am ffurfio hydrogeliau o NT a phroteinau spidroin ailgyfunol eraill trwy ddeor hydoddiant protein ar 37 ° C (Ffigur 1).Rydym yn dangos bod gelation yn gysylltiedig â thrawsnewid α-helices yn haenau-β a ffurfio ffibrilau tebyg i amyloid (Ffig. 3 a 4).Mae'r canfyddiad hwn yn syndod gan fod NTs yn fwndeli globular pum helics wedi'u torchi sy'n adnabyddus am eu hydoddedd hynod o uchel a'u sefydlogrwydd uchel mewn crynodiadau >200 mg/mL ar 4°C am sawl diwrnod27.Yn ogystal, mae NTs yn ail-blygu'n rhwydd ar ôl dadnatureiddio gwres ar grynodiadau protein isel mewn µM.Yn ôl ein canlyniadau, mae ffurfio ffibril yn gofyn am gyfuniad o grynodiad> 10 mg/mL o brotein a thymheredd ychydig yn uwch (Ffig. 1).Mae hyn yn gyson â'r syniad y gall ffibrilau amyloid ffurfio o broteinau wedi'u plygu'n gyfan gwbl sydd mewn cyflwr rhannol heb ei blygu oherwydd amrywiadau thermol o dan amodau ffisiolegol 48 .Mae enghreifftiau o broteinau sy'n cael y trawsnewidiad hwn yn cynnwys inswlin49,50, β2-microglobwlin, transthyretin a lysosym51,52,53.Er bod NT yn α-helix yn ei gyflwr brodorol, mae tua 65% o'r gadwyn polypeptid yn gydnaws â ffurfio zipper sterig (Ffig. 4e) 45 .Gan fod y monomer yn symudol yn ddeinamig46, gall ddatgelu'r rhanbarthau amyloidogenig posibl hyn ar dymheredd cymharol uchel a gall crynodiadau uchel o gyfanswm protein gyrraedd crynodiad critigol ar gyfer ffurfio ffibril amyloid54.Yn dilyn y rhesymu hwn, canfuwyd cydberthynas negyddol rhwng crynodiad spidroin ac amser gelation (Ffig. 1c), ac os caiff y cydffurfiad monomerig NT ei sefydlogi naill ai gan dreigladau (NT*, His-NT-L6) neu drwy ychwanegu halen, gall atal y hydrogeliau ffurfio (Ffig. 5).
Yn y rhan fwyaf o achosion, mae ffibrilau amyloid yn diflannu o hydoddiant fel gwaddod, ond o dan rai amodau gallant ffurfio hydrogeliau55,56,57.Yn nodweddiadol, mae gan ffibrilau sy'n ffurfio hydrogel gymhareb agwedd uchel ac maent yn ffurfio rhwydweithiau tri dimensiwn sefydlog trwy gysylltiad moleciwlaidd,55,58 sy'n gyson â'n canlyniadau.Ar gyfer ffurfiant hydrogel in vitro, mae proteinau yn aml yn cael eu dadblygu'n llawn neu'n rhannol, er enghraifft, trwy ddod i gysylltiad â thoddyddion organig, tymheredd uchel (70–90°C) a/neu pH isel (1.5–3.0)59,60,61,62.Nid oes angen prosesu llym ar yr hydrogeliau spidroin a ddisgrifir yma, ac nid oes angen cyfryngau croesgysylltu arnynt i sefydlogi'r hydrogeliau.
Adroddwyd yn flaenorol bod ailddarllediadau spidroin a QDs, sy'n ymddangos fel petaent yn cael eu newid β-dalen yn ystod nyddu sidan, yn ffurfio hydrogeliau.O'i gymharu â'n canfyddiadau, roedd amseroedd deori a/neu dymereddau deori yn sylweddol hirach neu'n uwch, yn y drefn honno, ac roedd yr hydrogeliau canlyniadol yn aml yn afloyw (Ffigur 7 a Thabl Atodol 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Yn ogystal ag amseroedd gel cyflym, perfformiodd hydrogeliau NT >300 mg/mL (30%) yn well na'r holl hydrogeliau protein sidan pry cop ailgyfunol eraill a ddisgrifiwyd, yn ogystal â hydrogeliau naturiol fel gelatin, alginad (2%), agar (0.5 % ) a cholagen.(0.6%) (Ffigur 7 a Thablau Atodol 1 a 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Cymharwyd amser gel a modwlws elastig yr hydrogeliau yn yr astudiaeth hon â hydrogeliau eraill sy'n seiliedig ar spidroin a hydrogeliau naturiol dethol.Rhoddir cyfeiriadau ynghyd â disgrifiad o'r amodau gelation.APS Amonium persulfate, tymheredd ystafell.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Mae'n ymddangos bod pryfed cop wedi datblygu ffyrdd o atal spidroin rhag gellio wrth storio.Er gwaethaf y crynodiad uchel o brotein yn y chwarren sidan, mae'r rhanbarth ailadrodd mawr sy'n gysylltiedig â'r parth terfynol yn golygu bod y crynodiad ymddangosiadol o NT a CT yn y chwarren yn cyfateb i oddeutu 10-20 mg / ml, ar ffin yr astudiaeth hon.sy'n ofynnol ar gyfer ffurfiant hydrogel a arsylwyd mewn vitro.Yn ogystal, roedd crynodiadau tebyg o halwynau 16 yn sefydlogi YG, fel mewn chwarennau sidan (Ffig. 5b).Astudiwyd cydffurfiad NT yn y cytosol E. coli a chanfuwyd ei fod wedi'i blygu'n dynnach nag o'i archwilio in vitro, sy'n dangos ymhellach bod halen neu ffactorau eraill yn atal ei agregu in vivo.Fodd bynnag, gall gallu NTs i drawsnewid yn ffibrilau β-dalen fod yn bwysig ar gyfer ffurfio ffilament a dylid ymchwilio iddo mewn astudiaethau yn y dyfodol.
Yn ogystal â'r agweddau newydd ar ffurfiant ffibril a hydrogel tebyg i NT-amyloid a welwyd yn yr astudiaeth hon, rydym hefyd yn dangos y gallai fod gan y ffenomen hon gymwysiadau biotechnolegol a biofeddygol (Ffig. 8).Fel prawf o gysyniad, fe wnaethom gyfuno NT â GFP neu PNP a dangos bod y protein ymasiad hefyd yn ffurfio hydrogeliau wrth ddeor ar 37 ° C a bod y ffracsiynau GFP a PNP i raddau helaeth yn cadw eu gweithgaredd ar ôl gelation (Ffigur 6).Mae ffosfforylasau niwcleosid yn gatalyddion pwysig ar gyfer synthesis analogau niwcleosid75, sy'n gwneud ein darganfyddiad yn berthnasol i'r diwydiant biofferyllol.Mae'r cysyniad o fynegi proteinau ymasiad sy'n ffurfio hydrogeliau tryloyw o dan amodau ffafriol yn caniatáu creu hydrogeliau swyddogaethol sydd â phriodweddau ffafriol ar gyfer ystod eang o gymwysiadau megis ansymudiad ensymau, rhyddhau cyffuriau rheoledig a pheirianneg meinwe.Yn ogystal, mae NT ac NT* yn farcwyr mynegiant effeithlon30, sy'n golygu y gellir defnyddio NT a'i amrywiadau ar gyfer cynhyrchu trwygyrch uchel o broteinau ymasiad hydawdd a chreu proteinau targed ansymudol mewn hydrogeliau 3D wedi hynny.
Mae NT yn hydawdd, α-helical ac yn sefydlog ar grynodiadau isel (µM) a 37 ° C.Ar yr un tymheredd, ond wrth gynyddu crynodiadau (> 10 mg/ml), mae NT yn ffurfio geliau sy'n cynnwys ffibrilau tebyg i amyloid.Mae proteinau ymasiad NT hefyd yn ffurfio geliau ffibrilaidd gyda darnau ymasiad cwbl weithredol, gan ganiatáu i broteinau amrywiol gael eu hatal rhag symud mewn hydrogeliau 3D gan ddefnyddio NT.Gwaelod: NT (PDB: 4FBS) a darluniau o rwydweithiau ffibr a strwythurau protein cysylltiedig (yn ganiataol a heb eu tynnu i raddfa, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2).
Cafodd y lluniadau (gweler Tabl Atodol 4 am restr gyflawn gan gynnwys dilyniannau asid amino) eu clonio i mewn i plasmid pT7 a'u trawsnewid yn E. coli BL21 (DE3).Cafodd E. coli yn cynnwys plasmidau peirianyddol eu brechu mewn cawl Luria wedi'i ategu â kanamycin (70 mg/l) a'i dyfu dros nos ar 30°C a 250 rpm.Yna cafodd y diwylliant ei frechu 1/100 i gyfrwng LB yn cynnwys kanamycin a'i feithrin ar 30 ° C a 110 rpm nes i'r OD600 gyrraedd 0.8.Ar gyfer astudiaethau NMR, tyfwyd bacteria mewn cyfrwng lleiaf M9 yn cynnwys 2 g o D-glwcos 13C (Aldrich) ac 1 go amoniwm clorid 15N (Caergrawnt Isotop Laboratories, Inc.) ar gyfer labelu protein ag isotopau.Gostyngwch y tymheredd i 20 gradd Celsius a chymell mynegiant protein gyda isopropylthiogalactopyranoside 0.15 mM (crynodiad terfynol).Ar ôl mynegiant protein dros nos, cynaeafwyd celloedd ar 7278 × g, 4 ° C am 20 munud.Cafodd pelenni celloedd eu hailddarparu mewn 20 mM Tris-HCl, pH 8, a'u rhewi nes eu defnyddio ymhellach.Cafodd celloedd dadmer eu lysu gan ddefnyddio aflonyddwr celloedd (peiriannau cyfres TS, Constant Systems Limited, Lloegr) ar 30 kPa.Yna cafodd y lysates eu centrifugio ar 25,000 g am 30 munud ar 4 ° C.Ar gyfer NTMiSp, cafodd y belen ei haildynnu wedyn mewn wrea 2 M, 20 mM Tris-HCl, pH 8, a'i sonigeiddio am 2 funud (2 s ymlaen / i ffwrdd, 65%), yna ei allgyrchu eto ar 25,000 xg, 4 ° C. o fewn 30 mun.Cafodd yr uwchnatant ei lwytho ar golofn Ni-NTA, ei olchi â 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, ac yn olaf cafodd y protein ei guddio â 20 mM Tris-HCl, imidazole 200 mM, pH 8. I gynhyrchu NT2RepCT a Mae NTCT, treuliad thrombin yn cyflwyno'r safle (ThrCleav) rhwng Ei a'r NT.Mae safleoedd holltiad thrombin hefyd yn bresennol yn His-NT-ThrCleav-2Rep (yn cynhyrchu 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (yn cynhyrchu NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (yn cynhyrchu CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (yn cynhyrchu NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (yn cynhyrchu NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (yn cynhyrchu NTF1Sp), a Ei-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (yn cynhyrchu NTMIP).Cafodd y lluniadau eu treulio â thrombin (1:1000) a'u dialyzed dros nos ar 4 ° C. gyda 20 mM Tris-HCl, pH 8, gan ddefnyddio pilen dialysis Spectra / Por gyda throthwy pwysau moleciwlaidd o 6-8 kDa.Ar ôl dialysis, caiff yr hydoddiant ei lwytho ar golofn Ni-NTA a chesglir yr elifiant sy'n cynnwys y protein o ddiddordeb.Pennwyd crynodiadau protein trwy fesur amsugnedd UV ar 280 nm gan ddefnyddio cyfernod difodiant pob protein, ac eithrio NTF1Sp, a ddefnyddiodd assay Bradford yn unol â phrotocol y gwneuthurwr.Pennwyd purdeb gan polyacrylamid SDS (4-20%) electrofforesis gel a staenio glas gwych Coomassie.Crynhowyd proteinau gan ddefnyddio hidlwyr centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) ar 4000 xg gyda thoriad pwysau moleciwlaidd 10 kDa mewn cylchoedd 20 munud.
Dadmer yr hydoddiant protein a phibed yn ofalus 150 µl i ffiol septwm clir 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Cafodd y tiwbiau eu capio a'u selio â pharafilm i atal anweddiad.Cafodd samplau (n = 3) eu deor ar 37°C neu 60°C a'u gwrthdroi o bryd i'w gilydd i arsylwi gelation.Deorwyd samplau nad oedd yn gel am o leiaf wythnos.Lleihau bondiau disulfide NTMiSp gyda 10 mM DTT fesul 10 µM protein.I ddadansoddi gelation haenau sidan pry cop naturiol, torrwyd y pry cop bont Sweden, gosodwyd y ddau brif chwarennau ampwl mewn 200 μl o 20 mM clustogi Tris-HCl pH 8 a'u torri i ganiatáu i'r cotio wahanu oddi wrth y chwarennau..Mae cynnwys y chwarennau'n cael eu hydoddi mewn byffer, 50 µl ar gyfer pennu pwysau sych (trwy ddeori ffiolau agored ar 60 °C i bwysau cyson) a 150 µl ar gyfer gelation ar 37 °C.
Mae'r geometreg / offeryn mesur wedi'i wneud o ddur di-staen gan ddefnyddio plât cyfochrog â diamedr uchaf o 20 mm a bwlch o 0.5 mm.Cynhesu'r sampl o 25 ° C i 45 ° C ac yn ôl i 25 ° C ar gyfradd o 1 ° C y funud gan ddefnyddio plât Peltier gwaelod dur di-staen.Gwnaed mesuriadau dirgrynol ar amledd o 0.1 Hz ac yn rhanbarth viscoelastig llinol y deunydd ar straen o 5% a 0.5% ar gyfer samplau o 100 mg/mL a 300-500 mg/mL, yn y drefn honno.Defnyddiwch siambr lleithder arferol i atal anweddiad.Dadansoddwyd data gan ddefnyddio Prism 9.
Ar gyfer casglu sbectra isgoch (IR) ar dymheredd ystafell o 800 i 3900 cm-1.Mae'r ddyfais ATR, yn ogystal â'r llwybr golau trwy'r sbectromedr, yn cael ei lanhau ag aer sych wedi'i hidlo cyn ac yn ystod yr arbrawf.Cafodd datrysiadau (500 mg/mL i leihau copaon amsugno dŵr yn y sbectra) eu pibedu ar y crisialau, a ffurfiwyd geliau (500 mg/mL) cyn eu mesur ac yna eu trosglwyddo i'r crisialau (n = 3).Cofnodwyd 1000 o sganiau gyda chydraniad o 2 cm-1 a chylch dyletswydd sero o 2. Cyfrifwyd yr ail ddeilliad gan ddefnyddio OPUS (Bruker) gan ddefnyddio ystod llyfnu o naw pwynt.Cafodd y sbectra eu normaleiddio i'r un rhanbarth integreiddio rhwng 1720 a 1580 cm-1 gan ddefnyddio F. Menges “Spectragryph – Meddalwedd Sbectrosgopeg Optegol”.Mewn sbectrosgopeg ATR-IR, mae dyfnder treiddiad trawst isgoch i mewn i sampl yn dibynnu ar rif tonfedd, gan arwain at amsugniad cryfach ar rifau tonnau is nag ar rifau tonfedd uwch.Nid yw'r effeithiau hyn wedi'u cywiro ar gyfer y sbectra a ddangosir yn Ffigys.3 oherwydd eu bod yn fach iawn (Ffig Atodol 4).Cyfrifwyd sbectra cywir ar gyfer y ffigur hwn gan ddefnyddio meddalwedd Bruker OPUS.
Mewn egwyddor, mae meintioliad cynhwysfawr o gydffurfiadau protein yn bosibl ar ôl dadelfennu dibynadwy'r cydrannau o fewn brig amid I.Fodd bynnag, mae rhai rhwystrau yn codi yn ymarferol.Gall sŵn yn y sbectrwm ymddangos fel brigau (ffug) yn ystod y cyfnod datgymalu.Yn ogystal, mae'r brig oherwydd plygu dŵr yn cyd-fynd â lleoliad brig amide I a gall fod â maint tebyg ar gyfer samplau sy'n cynnwys llawer iawn o ddŵr, megis y gel dyfrllyd a astudiwyd yma.Felly, ni wnaethom geisio dadelfennu brig amide I yn llwyr, a dim ond i gefnogi dulliau eraill megis sbectrosgopeg NMR y dylid ystyried ein harsylwadau.
Cafodd toddiannau o 50 mg/ml NT a His-NT2RepCT eu gellio dros nos ar 37°C.Yna cafodd yr hydrogel ei wanhau â 20 mM Tris-HCl (pH 8) i grynodiad o 12.5 mg/ml, ei ysgwyd yn dda a'i bibed i dorri'r gel.Nesaf, cafodd yr hydrogel ei wanhau 10 gwaith gyda 20 mM Tris-HCl (pH 8), cymhwyswyd 5 μl o'r sampl i grid copr wedi'i orchuddio â formvar, a chafodd y sampl dros ben ei dynnu â phapur blotio.Golchwyd samplau ddwywaith gyda 5 µl o ddŵr MilliQ a'u staenio â fformat wranyl 1% am 5 munud.Tynnwch staen gormodol gyda phapur amsugnol, yna aer sychwch y rhwyll.Perfformiwyd delweddu ar y gridiau hyn gan ddefnyddio FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN yn gweithredu ar 100 kV.Recordiwyd y delweddau ar x 26,500 a x 43,000 o chwyddiadau gan ddefnyddio camera CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, yr Almaen).Ar gyfer pob sampl (n = 1), cofnodwyd 10–15 delwedd.Defnyddiwyd ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ ) ar gyfer dadansoddi delwedd a mesur diamedrau ffibr (n = 100, gwahanol ffibrau).Defnyddiwyd Prism 9 i gynnal profion t heb eu paru (dwy gynffon).Y ffibrilau cymedrig His-NT2RepCT ac NT oedd 11.43 (SD 2.035) a 7.67 (SD 1.389) nm, yn y drefn honno.Y cyfwng hyder (95%) yw -4.246 i -3.275.graddau rhyddid = 198, p < 0.0001.
Mesurwyd 80 µl o samplau hylif yn cynnwys 10 µM thioflavin T (ThT) mewn triphlyg (n = 3) o dan amodau statig gan ddefnyddio platiau gwaelod clir gwaelod du Corning 96 ffynnon (Corning Glass 3881, UDA).Cofnodwyd gwahaniaethau fflworoleuedd gan ddefnyddio hidlydd cyffro 440 nm a hidlydd allyriadau 480 nm (FLUOStar Galaxy o BMG Labtech, Offenburg, yr Almaen).Nid oedd y signal ThT yn dirlawn nac wedi'i ddiffodd, wrth i arbrofion gyda chrynodiadau gwahanol o ThT gael eu cynnal heb newid dwyster y signal.Cofnodi amsugnedd ar 360 nm ar gyfer mesur niwl.Ar gyfer arbrofion hadu, ffurfiwyd geliau 100 mg / mL ar 37 ° C., eu hailddarlledu, a'u defnyddio ar gyfer hadu ar gymarebau molar o 5%, 10%, ac 20%.Dadansoddwyd data gan ddefnyddio Prism 9.
Dadmer stociau o His-NT2RepCT ac NT >100 mg/mL ar rew a hidlo trwy hidlydd 0.22 µm.Cyfrifwyd crynodiadau trwy fesur amsugnedd ar 280 nm gan ddefnyddio Nanodrop.Mewn ffynhonnau o blât nad yw'n rhwymo du 96-ffynnon (Corning) gyda gwaelod clir, gwanhawyd samplau i 20 mg/ml mewn 20 mM Tris-HCl pH 8 a'u cymysgu â 5 μM ThT (crynodiad terfynol), cyfanswm crynodiad y sampl 50 μl cyfaint.Delweddwyd samplau bob 10 munud ar 37 ° C ar ficrosgop CellObserver (Zeiss) gyda sianel golau a drosglwyddir a setiau ffilter allyrru ac allyrru FITC ar gyfer delweddu ThT.Defnyddir lens 20x/0.4 ar gyfer delweddu.Defnyddiwyd Zen Blue (Zeiss) a ImageJ ( https://imagej.nih.gov/ ) ar gyfer dadansoddi delweddau.Paratowyd geliau hefyd o atebion NT a His-NT2RepCT ar grynodiad o 50 mg/mL yn cynnwys 20 mM Tris pH 8 a 5 µM ThT a'u deor ar 37 ° C am 90 munud.Trosglwyddwyd y darnau gel i ffynnon newydd sy'n cynnwys 20 mM Tris, pH 8, a 5 μM ThT mewn plât gwaelod clir du nad yw'n rhwymo 96.Caffael fflworoleuedd gwyrdd a delweddau maes llachar ar chwyddhad 20x/0.4.Defnyddiwyd ImageJ ar gyfer dadansoddi delweddau.
Ateb Cafwyd sbectra NMR ar 310 K ar sbectromedr Bruker Avance Neo 600 MHz wedi'i gyfarparu â Cryoprobe Maes Cyseiniant Pwls Pedair Plyg QCI (HFCN).Samplau NMR sy'n cynnwys protein homogenaidd 10 mg/mL wedi'i labelu â 13C, 15N, wedi'i hydoddi mewn 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Defnyddiwyd sifftiau cemegol NT2RepCT ar pH 6.7 i neilltuo brig 23 yn y sbectrwm 2D o 15N-HSQC.
Cofnodwyd sbectra solet NMR (MAS) nyddu ongl hud o 13C, hydrogeliau â label 15N ar sbectromedr Bruker Avance III HD ar 800 MHz wedi'i gyfarparu â stiliwr di-electron 3.2 mm 13C/15N{1H}.Rheolwyd tymheredd y sampl gan ddefnyddio llif nwy tymheredd amrywiol ar 277 K. Caffaelwyd cyseiniant cylchdro deupol dau-ddimensiwn (DARR)76 a sbectra ailgysylltu amledd radio (RFDR)77 ar amleddau MAS o 12.5 kHz a 20 kHz, yn y drefn honno.Perfformiwyd polareiddio traws (CP) o 1H i 13C gan ddefnyddio ramp llinellol o 60.0 i 48.0 kHz yn 1H, 61.3 / 71.6 kHz yn 13C (yn 12.5 / 20 kHz MAS) ac amser cyswllt 0.5-1 ms.Defnyddiwyd datgysylltu spinal6478 ar 73.5 kHz wrth gasglu data.Yr amser caffael oedd 10 milieiliad a'r oedi beicio oedd 2.5 eiliad.Neilltuwyd y cydberthnasau Cα/Cβ un-gysylltiedig a arsylwyd yn y sbectra RFDR yn seiliedig ar y sifftiau cemegol nodweddiadol math o weddillion a chydberthnasau aml-gysylltiedig yn y sbectra DARR.
Defnyddiwyd cronfa ddata Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) i werthuso tueddiadau ffluter ac egni Rosetta ar gyfer NT, NTFlSp, ac NTMiSp.Mae cronfa ddata Zipper yn cyfrifo Rosetta Energy80, sy'n cyfuno sawl swyddogaeth ynni am ddim i fodelu a dadansoddi strwythur protein.Mae lefel egni o -23 kcal/mol neu is yn dynodi tueddiad uchel i ffibriliad.Mae'r egni is yn golygu mwy o sefydlogrwydd y ddwy β-linyn yn y cydffurfiad zipper.Yn ogystal, defnyddiwyd algorithm Waltz i ragfynegi rhanbarthau amyloidogenig yn NT, NTFlSp a NTMiSp Cyf.81. ( https://waltz.switchlab.org/ ).
Cymysgwyd yr hydoddiant protein NT â byffer asid 2-(N-morpholino) ethanesulfonig (MES) ar pH 5.5 a 6.0 i ostwng y pH i pH 6 a 7, yn y drefn honno.Y crynodiad protein terfynol oedd 100 mg/ml.
Perfformiwyd mesuriadau ar sbectromedr CD J-1500 (JASCO, UDA) gan ddefnyddio cuvette 300 μL gyda llwybr optegol o 0.1 cm.Cafodd proteinau eu gwanhau i 10 μM (n = 1) mewn byffer ffosffad 20 mM (pH 8).I ddadansoddi sefydlogrwydd protein ym mhresenoldeb halen, dadansoddwyd proteinau ar yr un crynodiad (n = 1) mewn byffer ffosffad 20 mM (pH 8) sy'n cynnwys 154 mM NaF neu NaCl, yn y drefn honno.Cofnodwyd sganiau tymheredd ar 222 nm o 25°C i 95°C gyda chyfradd gwresogi o 1°C/munud.Cyfrifwyd cyfran y proteinau wedi'u plygu'n frodorol gan ddefnyddio'r fformiwla (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Yn ogystal, cofnodwyd pum sbectra ar gyfer pob sampl o 260 nm i 190 nm ar 25 ° C ac ar ôl gwresogi i 95 ° C.Cafodd pum sbectra eu cyfartaleddu, eu llyfnu a'u trosi'n eliptigedd molar.Dadansoddwyd data gan ddefnyddio Prism 9.
Mesurwyd dwyster fflworoleuedd His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) mewn triphlyg (n = 3) mewn platiau Corning 96-ffynnon gyda gwaelod tryloyw du (Corning Glass 3881, UDA) o dan amodau statig.Mesur samplau gyda darllenydd plât sy'n seiliedig ar fflworoleuedd gyda thonfedd cyffro o 395 nm a chofnodwch yr allyriad ar 509 nm cyn gelation a 2 awr yn ddiweddarach ar 37 ° C.Dadansoddwyd data gyda Prism 9.
Defnyddiwyd pecyn assay gweithgaredd ffosfforylase niwcleosid purine (dull fflworometrig, Sigma Aldrich) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.I fesur gweithgaredd mewn geliau a thoddiannau sy'n cynnwys His-NT-PNP, cymysgwch 10 ng o His-NT-PNP gyda 100 mg/mL NT i gyfanswm cyfaint o 2 µL oherwydd bod y gel yn rhoi signal uwchlaw cyfwng canfod y set.Cynhwyswyd rheolaethau ar gyfer geliau a datrysiadau heb Ei-NT-PNP.Cyflawnwyd y mesuriadau ddwywaith (n = 2).Ar ôl i'r gweithgaredd gael ei fesur, tynnwyd cymysgedd yr adwaith a thynnwyd llun y gel i sicrhau bod y gel yn aros yn gyfan yn ystod y mesuriad.Dadansoddwyd data gan ddefnyddio Prism 9.
I gael rhagor o wybodaeth am gynllun yr astudiaeth, gweler y crynodeb astudiaeth Natur sy'n gysylltiedig â'r erthygl hon.
Mae Ffigurau 1 a 2 yn cyflwyno'r data cychwynnol.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, a 6, Ffigys Atodol.3, ffig atodol.5a, d, ffig atodol.6 a ffig atodol.8. Data Mae data o'r astudiaeth hon yn cael ei gynnal yng nghronfa ddata Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Postiwyd y data NMR a gafwyd yn yr astudiaeth hon i gadwrfa BMRBig o dan yr ID cofnod bmrbig36.Cymerwyd strwythurau GFP a PNP o PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. a Johansson, J. Nyddu sidan pry cop artiffisial.Cemegol Cenedlaethol.bioleg.11, 309–315 (2015).
Mae Babb, PL et al.Mae genom Nephila clavipes yn amlygu amrywiaeth genynnau sidan pry cop a'u mynegiant cymhleth.Genette Cenedlaethol.49, 895–903 (2017).