347 12.7*1.24mm Tiwbiau torchog dur di-staen, Mecanwaith moleciwlaidd cyddwysiad electrostatig cydamserol a cheulo α-synuclein a tau

Diolch am ymweld â Nature.com.Rydych chi'n defnyddio fersiwn porwr gyda chefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn ogystal, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, rydym yn dangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Sliders yn dangos tair erthygl fesul sleid.Defnyddiwch y botymau cefn a nesaf i symud trwy'r sleidiau, neu'r botymau rheolydd sleidiau ar y diwedd i symud trwy bob sleid.

347 Manyleb Pibell Dur Di-staen

347 12.7*1.24mm Tiwbiau torchog dur gwrthstaen

Diamedr Allanol: 6.00 mm OD hyd at 914.4 mm OD, Maint hyd at 24” DS ar gael Cyn-stoc, Tiwbiau Dur Maint OD ar gael Cyn-stoc

SS 347 Ystod Trwch Pibell: 0.3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ac ati (0.5-12mm) Neu maint afreolaidd i'w deilwra yn ôl yr angen

Math: SS 347 Pibellau Di-dor |SS 347 ERW Pibellau |SS 347 Pibellau Wedi'u Weldio |SS 347 Pibellau Ffabredig |Tiwbiau CDW SS 347, Pibellau LSAW / Wedi'u weldio â sêm / wedi'u hail-lunio

Ffurf: SS 347 Pibellau / Tiwbiau Crwn, SS 347 Pibellau / Tiwbiau Sgwâr, SS 347 Pibellau / Tiwbiau Hirsgwar, SS 347 Tiwbiau Torchog, Siâp SS 347 “U”, Coiliau Teisen Sosban SS 347, SS 347 Tiwbiau Hydrolig

Hyd: Hap Sengl, Hap Dwbl a Hyd Gofynnol: Diwedd Plaen, Diwedd Beveled, Treaded

Diogelu Diwedd: Capiau Plastig |Gorffen y tu allan: 2B, Rhif 4, Rhif 1, Rhif 8 Drych Gorffen ar gyfer Pibellau Dur Di-staen, Gorffen yn unol â Gofynion y cwsmer

Amod Cyflwyno: Wedi'i Annealio a'i Biclo, Wedi'i sgleinio, wedi'i Anelio'n Ddisglair, Wedi'i Dynnu'n Oer

Arolygiad, Adroddiadau Prawf: Tystysgrifau Prawf Melin, EN 10204 3.1, Adroddiadau Cemegol, Adroddiadau Mecanyddol, Adroddiadau Prawf PMI, Adroddiadau Arolygu Gweledol, Adroddiadau Arolygu Trydydd Parti, Adroddiadau Lab Cymeradwy NABL, Adroddiad Prawf Dinistriol, Adroddiadau Prawf Annistrywiol

Pacio: Wedi'i bacio mewn blychau pren, bagiau plastig, stribedi dur wedi'u bwndelu, neu yn unol â Cheisiadau Cwsmeriaid

Nwyddau Arbennig: Gellir cynhyrchu Meintiau a Manylebau heblaw'r uchod ar gais

Amrediad Maint Pibell SS 347: 1/2 modfedd DS, OD i 24 modfedd

ASTM A312 347: Pibell austenitig weldio di-dor a sêm syth a fwriedir ar gyfer tymheredd uchel a gwasanaeth cyrydol cyffredinol.Ni chaniateir metel llenwi yn ystod weldio.

ASTM A358 347: Pibell austenitig wedi'i weldio ag ymasiad trydan ar gyfer gwasanaeth cyrydol a/neu dymheredd uchel.Yn nodweddiadol dim ond pibell hyd at 8 modfedd a gynhyrchir i'r fanyleb hon.Caniateir ychwanegu metel llenwi yn ystod weldio.

ASTM A790 347: Pibell ferritig/austenitig (deublyg) di-dor a sêm syth wedi'i weldio a fwriedir ar gyfer gwasanaeth cyrydol cyffredinol, gyda phwyslais arbennig ar ymwrthedd i gracio cyrydiad straen.

ASTM A409 347: Mae ymasiad trydan sêm syth neu wythïen droellog wedi'i weldio â phibell wal ysgafn austenitig diamedr mawr mewn meintiau 14” i 30” gyda waliau Sch5S a Sch 10S ar gyfer cyrydol a/neu uchel

ASTM A376 347: Pibell austenitig di-dor ar gyfer cymwysiadau tymheredd uchel.

ASTM A813 347: Pibell austenitig un-sêm, weldio sengl neu ddwbl ar gyfer cymwysiadau cyrydol tymheredd uchel a chyffredinol.

ASTM A814 347: Pibell austenitig wedi'i weldio â gwaith oer ar gyfer tymheredd uchel a gwasanaeth cyrydol cyffredinol.

347H Pibellau Dur Di-staen Cyfansoddiad Cemegol

Priodweddau Mecanyddol Pibell Dur Di-staen 347H

Pibellau Dur Di-staen 347H Priodweddau Corfforol

Graddau Cyfwerth ar gyfer Pibell Dur Di-staen 347H

Mae agregiad alffa-synuclein amyloid (αS) yn nodwedd amlwg o glefyd Parkinson a synucleinopathies eraill.Yn ddiweddar, mae'r protein tau a gysylltir yn gyffredin â chlefyd Alzheimer wedi'i gysylltu â phatholeg αS a chanfuwyd ei fod yn cyd-leoli mewn cynhwysiant sy'n gyfoethog mewn αS, er bod mecanwaith moleciwlaidd coaggregu'r ddau brotein yn parhau i fod yn aneglur.Rydym yn adrodd yma bod y cyfnod αS yn gwahanu i gyddwysiadau hylif trwy anwedd cymhleth electrostatig gyda polypeptidau â gwefr bositif fel tau.Yn dibynnu ar affinedd αS ar gyfer polycations a chyfradd dihysbyddu falens y rhwydwaith ceulo, mae ceuladau'n mynd trwy gelation neu gyfuniad cyflym ac yna agregu amyloid araf.Trwy gyfuno cyfres o dechnegau bioffisegol uwch, roeddem yn gallu nodweddu'r gwahaniad cyfnod hylif-hylif αS/Tau a nodi'r ffactorau allweddol sy'n arwain at ffurfio agregau heterogenaidd sy'n cynnwys y ddau brotein mewn cyddwysiad protein hylifol.
Yn ogystal â adrannau pilen, gellir gwahanu celloedd yn ofodol hefyd trwy ffurfio cyrff trwchus sy'n gyfoethog mewn protein, tebyg i hylif o'r enw cyddwysiadau neu ddefnynnau biomoleciwlaidd, trwy broses a elwir yn wahaniad cyfnod hylif-hylif (LLPS).Mae'r defnynnau hyn yn cael eu ffurfio gan ryngweithiadau tymhorol amlfalent, fel arfer rhwng proteinau neu broteinau ac RNA, ac maent yn gwasanaethu amrywiaeth o swyddogaethau ym mron pob system fyw.Mae nifer fawr o broteinau sy'n gallu LLP yn arddangos dilyniannau o gymhlethdod isel sy'n anhrefnus iawn eu natur ac wrth ffurfio cyddwysiadau biomoleciwlaidd3,4,5.Mae nifer o astudiaethau arbrofol wedi datgelu natur hyblyg, anhrefnus yn aml, ac amlfalent y proteinau sy'n ffurfio'r cyddwysiadau tebyg i hylif hyn, er mai ychydig a wyddys am y penderfynyddion moleciwlaidd penodol sy'n rheoli twf ac aeddfediad y cyddwysiadau hyn i ffurf mwy solet. gwladwriaeth..
Mae'r data newydd yn cefnogi'r ddamcaniaeth y gall LLPS affwysol sy'n cael ei yrru gan brotein a thrawsnewid defnynnau yn strwythurau solet fod yn llwybrau cellog perthnasol sy'n arwain at ffurfio agregau gwenwynig anhydawdd sy'n aml yn nodweddiadol o glefydau dirywiol.Mae llawer o broteinau ag anhwylder cynhenid ​​​​sy'n gysylltiedig â LLPS (IDPs), sy'n aml yn llawn gwefr ac yn hyblyg, wedi bod yn gysylltiedig ers amser maith â niwroddirywiad trwy'r broses o agregu amyloid.Yn benodol, dangoswyd bod cyddwysiadau IDP biomoleciwlaidd fel FUS7 neu TDP-438 neu broteinau â pharthau cymhlethdod isel mawr fel hnRNPA19 yn heneiddio i ffurfiau tebyg i gel neu hyd yn oed solet trwy broses a elwir yn hylifoli.cyfansawdd.i bontio cyfnod solet (LSPT) fel swyddogaeth amser neu mewn ymateb i rai addasiadau ôl-gyfieithu penodol neu dreigladau patholegol arwyddocaol1,7.
CDU arall sy'n gysylltiedig â LLPS in vivo yw Tau, protein anhwylder sy'n gysylltiedig â microtiwbwl y mae ei agregiad amyloid wedi'i gysylltu â chlefyd Alzheimer10 ond sydd hefyd wedi'i gysylltu'n ddiweddar â chlefyd Parkinson (PD) a phroteinopathïau niwclear synaptig eraill 11, 12, 13 yn gysylltiedig.Dangoswyd bod Tau yn datgysylltu'n ddigymell oddi wrth hydoddiant/cytoplasm oherwydd rhyngweithiadau electrostatig ffafriol14, gan arwain at ffurfio defnynnau wedi'u cyfoethogi â tau a elwir yn coacervates electrostatig.Gwelwyd hefyd mai'r math hwn o ryngweithio amhenodol yw'r grym y tu ôl i lawer o gyddwysiadau biomoleciwlaidd eu natur15.Yn achos protein tau, gellir ffurfio agregu electrostatig trwy agregu syml, lle mae rhanbarthau o'r protein â gwefr gyferbyniol yn sbarduno'r broses holltiad, neu drwy gydgrynhoi cymhleth trwy ryngweithio â pholymerau â gwefr negyddol fel RNA.
Yn ddiweddar, mae α-synuclein (αS), IDP amyloid sy'n gysylltiedig â PD a chlefydau niwroddirywiol eraill a elwir gyda'i gilydd yn synucleinopathi17,18, wedi'i ddangos mewn modelau cellog ac anifeiliaid19,20 wedi'u crynhoi mewn cyddwysiadau protein ag ymddygiad tebyg i hylif.Mae astudiaethau in vitro wedi dangos bod αS yn mynd trwy LLPS trwy agregu syml trwy ryngweithiadau hydroffobig yn bennaf, er bod y broses hon yn gofyn am grynodiadau protein eithriadol o uchel ac amseroedd deori hir yn annodweddiadol19,21.Mae p'un a yw'r cyddwysiadau sy'n cynnwys αS a arsylwyd in vivo yn cael eu ffurfio gan y prosesau LLPS hwn neu rai eraill yn parhau i fod yn fater allweddol heb ei ddatrys.Yn yr un modd, er bod agregu amyloid αS wedi'i arsylwi mewn niwronau mewn PD a synucleinopathies eraill, mae'r union fecanwaith y mae αS yn ei ddefnyddio i gydgrynhoi amyloid mewngellol yn parhau i fod yn aneglur, gan nad yw'n ymddangos bod gorfynegiant y protein hwn yn sbarduno'r broses hon ar ei ben ei hun.Mae angen difrod cellog ychwanegol yn aml, sy'n awgrymu bod angen rhai lleoliadau cellog neu ficroamgylcheddau ar gyfer adfywiad cynulliadau amyloid αS mewngellol.Un amgylchedd cellog sy'n arbennig o dueddol o agregu yw'r tu mewn i gyddwysiadau protein 23 .
Yn ddiddorol, canfuwyd bod αS a tau yn cyd-leoli mewn cynhwysiant clefydau nodweddiadol mewn pobl â chlefyd Parkinson a synucleinopathies 24,25 eraill ac mae arbrofion wedi nodi perthynas patholegol synergaidd rhwng y ddau brotein 26,27 sy'n awgrymu perthynas bosibl rhwng agregu αS a tau mewn clefydau niwroddirywiol.salwch.Canfuwyd bod αS a tau yn rhyngweithio ac yn hyrwyddo agregu ei gilydd mewn vitro ac in vivo 28,29 ac mae agregau heterogenaidd sy'n cynnwys y ddau brotein hyn wedi'u harsylwi yn ymennydd cleifion â synucleinopathies 30 .Fodd bynnag, ychydig a wyddys am sail moleciwlaidd y rhyngweithio rhwng αS a tau a mecanwaith ei gyd-gasgliad.Adroddwyd bod αS yn rhyngweithio â tau trwy atyniad electrostatig rhwng rhanbarth terfynell C αS â gwefr negyddol iawn a rhanbarth canolog cyfoethog proline tau, sydd hefyd wedi'i gyfoethogi mewn gweddillion â gwefr bositif.
Yn yr astudiaeth hon, rydym yn dangos y gall αS yn wir ddatgysylltu i ddefnynnau trwy gyddwysiad cymhleth electrostatig ym mhresenoldeb protein tau, yn wahanol i'w ryngweithio â polypeptidau eraill â gwefr bositif fel poly-L-lysin (pLK), ac yn y broses hon .Mae αS yn gweithredu fel moleciwl sgaffald ar gyfer y rhwydwaith defnynnau.Rydym wedi nodi gwahaniaethau amlwg yn y broses o aeddfedu coacervates αS electrostatig, sy'n gysylltiedig â gwahaniaethau yn y falens a chryfder y rhyngweithio proteinau sy'n ymwneud â'r rhwydwaith coacervate.Yn ddiddorol, gwelsom gyd-agregu proteinau amyloid αS a tau mewn coacervates hylif hirhoedlog a nodwyd rhai ffactorau allweddol sy'n arwain at gyd-agregu'r ddau broteinau hyn mewn coacervates o'r fath.Yma rydym yn disgrifio'r broses hon yn fanwl, sy'n fecanwaith moleciwlaidd posibl sy'n sail i gydleoli dau brotein mewn cynhwysiadau sy'n benodol i glefydau.
Mae gan αS gynffon terfynell C anionig iawn ar pH niwtral (Ffig. 1a), a thybiwyd gennym y gallai gael LLPS trwy gyddwysiad cyfadeiladau electrostatig â moleciwlau polypeptid ag anhwylder polycationig.Fe wnaethom ddefnyddio poly-L-lysin (pLK) 100-gweddillion fel y moleciwl model cychwynnol oherwydd ei natur polymerig â gwefr bositif ac anhrefnus ar pH niwtral 32. Yn gyntaf, cadarnhawyd bod pLK yn rhyngweithio â pharth Ct αS trwy sbectrosgopeg Ateb NMR (Ffigur 1b) gan ddefnyddio αS â label 13C/15N ym mhresenoldeb cymarebau molar αS:pLK cynyddol.Mae rhyngweithiad pLK â pharth Ct αS yn amlygu ei hun mewn aflonyddwch yn y symudiad cemegol a gostyngiad yn y dwysedd brig yn y rhan hon o'r protein.Yn ddiddorol, pan wnaethom gymysgu αS gyda pLK ar grynodiad αS o tua.5–25 µM ym mhresenoldeb polyethylen glycol (5–15% PEG-8) (byffer LLPS nodweddiadol: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) aethom ar unwaith trwy faes eang o ffurfio protein .arsylwyd defnynnau gan ddefnyddio fflworoleuedd (WF) a llachar-cae (BF) microsgopeg (Ffig. 1c).defnynnau 1-5 µm sy'n cynnwys αS crynodedig (ychwanegwyd 1 µM AlexaFluor488-label αS, AF488-αS), gall eu priodweddau electrostatig ddeillio o'u gwrthiant i 10% 1,6-hecsanediol (1,6-HD) a'i sensitifrwydd i cynnydd mewn crynodiad NaCl (Ffig. 1c).Mae natur hylif-debyg y coacervates y αS / plk electrostatig cymhleth yn cael ei ddangos gan eu gallu i ffiws o fewn milieiliadau (Ffig. 1d).Gan ddefnyddio tyrbidimetreg, fe wnaethom feintioli ffurfio defnynnau o dan yr amodau hyn, cadarnhau natur electrostatig y prif ryngweithio sy'n gysylltiedig â'i sefydlogrwydd (Ffig. 1e), a gwerthuso effaith cymarebau polymerau amrywiol ar y broses LLPS (Ffig. 1f).Er y gwelir ffurfio defnynnau dros ystod eang o gymarebau polymerau, mae'r broses yn ffafriol iawn pan fo pLK yn fwy na αS.Gwelwyd PACau hefyd yn defnyddio'r asiant dadleoli cemegol gwahanol dextran-70 (70 kDa) neu'n defnyddio amrywiaeth o fformatau sampl, gan gynnwys diferion sleidiau gwydr, ffynhonnau microplate o ddeunyddiau amrywiol, Eppendorf neu gapilarïau cwarts.
cynrychiolaeth sgematig o wahanol ranbarthau protein yn yr amrywiadau WT-αS a ΔCt-αS a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon.Dangosir y parth terfynell N amffipathig, y rhanbarth ffurfio amyloid hydroffobig (NAC), a'r parth terfynell C â gwefr negyddol mewn glas, oren, a choch, yn y drefn honno.Dangosir y map Tâl Net Fesul Gweddilliol (NCPR) o WT-αS.b Dadansoddiad NMR o'r rhyngweithiad αS/pLK yn absenoldeb clystyrau macromoleciwlaidd.Wrth i grynodiad pLK gynyddu (dangosir cymarebau molar αS:pLK o 1:0.5, 1:1.5, ac 1:10 mewn gwyrdd golau, gwyrdd, a gwyrdd tywyll, yn y drefn honno).c Coacervate αS/pLK (cymhareb molar 1:10) ar 25 µM (1 µM AF488-label αS neu Atto647N-label label ar gyfer delweddu WF) mewn byffer LLPS (top) neu wedi'i ategu â 500 mM NaCl (gwaelod chwith) neu ar ôl 500 mM % 1,6-hecsanediol (1,6-HD; gwaelod dde).Bar graddfa = 20 µm.d Delweddau microsgopig cynrychioliadol o ymasiad defnynnau BF o αS/pLK (cymhareb molar 1:10) ar grynodiad o 25 μM;mae saethau'n dynodi bod diferion unigol (saethau coch a melyn) wedi'u huno yn gwymp newydd (saeth oren) o fewn 200 ms).Bar graddfa = 20 µm.e Gwasgariad golau (ar 350 nm) αS/pLK agregu mewn byffer LLPS cyn ac ar ôl ychwanegu 500 mM NaCl neu 10% 1,6-HD ar 25 µM αS (N = 3 atgynhyrchiad sampl, dynodiad cymedrig a gwyriad safonol hefyd).f Delwedd BF (brig) a dadansoddiad gwasgariad golau (ar 350 nm, gwaelod) o agregiad αS/pLK ar 25 μM αS gyda chymhareb molar αS:pLK cynyddol (dyblygiad sampl N = 3, dynodiad cymedrig a gwyriad safonol hefyd).Bar graddfa = 10 µm.Mae'r bar graddfa ar un ddelwedd yn dangos graddfa'r holl ddelweddau mewn un panel.Darperir data crai ar ffurf ffeiliau data crai.
Yn seiliedig ar ein harsylwadau o anwedd electrostatig cymhleth αS/pLK ac arsylwadau blaenorol o αS fel moleciwl cleient o'r cyddwysiad tau/RNA trwy ryngweithio uniongyrchol â tau31, gwnaethom ddamcaniaethu y gallai αS a tau gyd-wahanu â'r toddydd yn absenoldeb RNA anwedd.trwy gymhlygau electrostatig, ac αS yw'r protein sgaffald mewn coacervates αS/Tau (gweler dosraniad gwefr tau yn Ffigur 2e).Gwelsom pan gymysgwyd 10 μM αS a 10 μM Tau441 (yn cynnwys 1 μM AF488-αS ac 1 μM Atto647N-Tau, yn y drefn honno) gyda'i gilydd mewn byffer LLPS, roeddent yn hawdd ffurfio agregau protein yn cynnwys y ddau brotein, fel y gwelir gan ficrosgopeg WF.(Ffig. 2a).Cadarnhawyd cydleoli'r ddau brotein yn y defnynnau gan ficrosgopeg confocal (CF) (Ffig Atodol 1a).Gwelwyd ymddygiad tebyg pan ddefnyddiwyd dextran-70 fel asiant agregu (Ffig Atodol 1c).Gan ddefnyddio naill ai PEG neu dextran wedi'i labelu gan FITC, canfuom fod y ddau asiant gorlenwi wedi'u dosbarthu'n gyfartal ar draws y samplau, gan ddangos nad oedd unrhyw wahanu na chysylltiad (Ffig Atodol 1d).Yn hytrach, mae'n awgrymu eu bod yn y system hon yn hyrwyddo gwahanu fesul cam trwy effeithiau gorlenwi macromoleciwlaidd, gan fod PEG yn asiant gorlenwi sefydlog ffafriol, fel y gwelir mewn systemau LLP eraill33,34.Roedd y diferion hyn sy'n llawn protein yn sensitif i NaCl (1 M) ond nid i 1,6-HD (10% v/v), gan gadarnhau eu priodweddau electrostatig (Ffig Atodol 2a, b).Cadarnhawyd eu hymddygiad hylifol trwy arsylwi digwyddiadau defnynnau uno milieiliad gan ddefnyddio microsgopeg BF (Ffig. 2b).
a delweddau microsgopeg Confocal (CF) o αS/Tau441 yn coacervates mewn byffer LLPS (10 μM o bob protein, 0.5 μM o AF488-label αS a Atto647N-label Tau441).b Delweddau cyferbyniol ymyrraeth wahaniaethol cynrychioliadol (DIC) o ddigwyddiadau ymasiad defnynnau αS/Tau441 (10 μM ar gyfer pob protein).c Diagram cyfnod yn seiliedig ar wasgariad golau (ar 350 nm) o Tau441 LLPS (0–15 µM) yn absenoldeb (chwith) neu bresenoldeb (dde) o 50 µM αS.Mae lliwiau cynhesach yn dangos mwy o wasgaru.d Gwasgariad ysgafn o samplau LLPS αS/Tau441 gyda chrynodiad αS cynyddol (Tau441 ar 5 µM, N = 2–3 ailadrodd sampl fel y nodir).e Cynrychiolaeth sgematig o rai amrywiadau protein tau a gwahanol ranbarthau o'r protein a ddefnyddir yn yr astudiaeth hon: parth terfynell N â gwefr negyddol (coch), rhanbarth cyfoethog proline (glas), parth rhwymo microtiwb (MTBD, wedi'i amlygu mewn oren), a troellog pâr sy'n ffurfio amyloid.rhanbarthau ffilament (PHF) wedi'u lleoli o fewn y MTBD (llwyd).Dangosir y map Tâl Net Fesul Gweddill (NCPR) o Tau441.f Defnyddio 1 µM AF488-labelu αS ac Atto647N-labelu ΔN-, gan ddefnyddio 1 µM AF488-labelu αS neu ΔCt-αS ym mhresenoldeb ΔNt-Tau (top, 10 µM fesul protein) neu K18 protein (gwaelod) ) ) ) micrograffau o WF wedi'u cyddwyso mewn LLPS neu glustogfa K18.Mae'r bariau graddfa mewn un ddelwedd yn cynrychioli graddfa'r holl ddelweddau mewn un panel (20 µm ar gyfer paneli a, b ac f).Darperir data crai ar gyfer paneli c a d fel ffeiliau data crai.
Er mwyn profi rôl αS yn y broses LLPS hon, fe wnaethom ymchwilio'n gyntaf i effaith αS ar sefydlogrwydd defnynnau gan nephelometreg gan ddefnyddio crynodiadau cynyddol o NaCl (Ffig. 2c).Po uchaf yw'r crynodiad halen yn y samplau sy'n cynnwys αS, yr uchaf yw'r gwerthoedd gwasgaru golau (ar 350 nm), sy'n nodi rôl sefydlogi αS yn y system LLPS hon.Gellir gweld effaith debyg trwy gynyddu'r crynodiad αS (ac felly'r gymhareb αS:Tau441) i tua.Cynnydd 10-plyg o'i gymharu â'r crynodiad tau (5 µM) (Ffig. 2d).Er mwyn dangos bod αS yn brotein sgaffald mewn coacervates, fe wnaethom benderfynu ymchwilio i ymddygiad y mutant Tau sy'n cael ei amharu ar LLPS, nad oes ganddo ranbarth terfynell N â gwefr negyddol (gweddillion 1-150, gweler Ffig. 2e) o'r enw ΔNt-Tau.Cadarnhaodd microsgopeg a nephelometreg WF nad oedd ΔNt-Tau ei hun yn destun LLPS (Ffig. 2f a Ffig. Atodol 2d), fel yr adroddwyd yn flaenorol 14. Fodd bynnag, pan ychwanegwyd αS at atebion gwasgariad yr amrywiad Tau cwtogi hwn, roedd y broses LLPS yn gyfan gwbl wedi'i adfer gyda dwysedd defnynnau yn agos at ddwysedd defnynnau hydoddiannau maint llawn o Tau ac αS o dan amodau tebyg a chrynodiadau protein.Gellir arsylwi'r broses hon hefyd o dan amodau gorlenwi macromoleciwlaidd isel (Ffig Atodol 2c).Dangoswyd rôl y rhanbarth C-terminal αS, ond nid ei hyd cyfan, yn y broses LLPS gan ataliad ffurfio defnynnau gan ddefnyddio amrywiad C-terminal cwtogi αS diffyg gweddillion 104-140 (Ffig. 1a) o'r (ΔCt-) αS) protein (Ffig. 2dd a Ffig. Atodol 2d).Cadarnhawyd cydleoli αS a ΔNt-Tau gan ficrosgopeg fflworoleuedd confocal (Ffig Atodol 1b).
I brofi'r mecanwaith LLPS ymhellach rhwng Tau441 a αS, defnyddiwyd amrywiad Tau ychwanegol, sef y darn craidd ffilament helical (PHF) pâr yn y parth rhwymo microtiwb (MTBD), ac os yw'n cynnwys pedwar parth ailadrodd nodweddiadol, a elwir hefyd yn gyffredin. fel y darn K18 (gweler Ffig. 2d).Adroddwyd yn ddiweddar bod αS yn rhwymo'n ffafriol i brotein tau sydd wedi'i leoli mewn parth llawn proline mewn dilyniant sy'n rhagflaenu'r parth rhwymo microtiwb.Fodd bynnag, mae rhanbarth PHF hefyd yn gyfoethog mewn gweddillion â gwefr bositif (gweler Ffigur 2e), yn enwedig lysin (gweddillion 15%), a ysgogodd ni i brofi a yw'r rhanbarth hwn hefyd yn cyfrannu at anwedd y cyfadeilad αS/Tau.Gwelsom na allai K18 ar ei ben ei hun sbarduno LLPS mewn crynodiadau hyd at 100 μM o dan yr amodau a brofwyd (byffer LLPS gyda 15% PEG neu 20% dextran) (Ffigur 2f).Fodd bynnag, pan wnaethom ychwanegu 50 µM αS i 50 µM K18, ffurfio cyflym o ddefnynnau protein sy'n cynnwys K18 a αS arsylwyd gan nephelometreg (Atodol Ffig. 2d) a WF microsgopeg (Ffig. 2f).Yn ôl y disgwyl, nid oedd ΔCt-αS yn gallu adfer ymddygiad LLPS K18 (Ffig. 2f).Nodwn fod agregiad αS/K18 yn gofyn am grynodiadau protein ychydig yn uwch i gymell LLPS o gymharu â αS/ΔNt-Tau neu αS/Tau441, gyda phethau eraill yn gyfartal.Mae hyn yn gyson â rhyngweithiad cryfach rhwng rhanbarth terfynell C αS â'r parth Tau llawn proline o'i gymharu â'r parth rhwymo microtiwb, fel y disgrifiwyd yn flaenorol 31 .
O ystyried na all ΔNt-Tau berfformio LLPS yn absenoldeb αS, fe wnaethom ddewis yr amrywiad Tau hwn fel model ar gyfer nodweddu αS/Tau LLPS o ystyried ei symlrwydd mewn systemau LLPS gyda Tau hyd llawn (isoteip, Tau441 / Tau441).gyda phrosesau agregu cymhleth (heteroteipig, αS/Tau441).Fe wnaethom gymharu gradd agregu αS (fel rhan o'r protein cyfnod cyddwys, fαS, c) yn y systemau αS / Tau a αS / ΔNt-Tau yn ôl dadansoddiad allgyrchu a chyfnod gwasgaredig SDS-PAGE (gweler 2e), canfuwyd gwerthoedd tebyg iawn ar gyfer pob protein ar yr un crynodiad.Yn benodol, cawsom fαS, c 84 ± 2% a 79 ± 7% ar gyfer αS / Tau a αS / ΔNt-Tau, yn y drefn honno, gan awgrymu bod y rhyngweithio heteroteipig rhwng αS a tau yn well na'r rhyngweithio rhwng moleciwlau tau.rhwng.
Astudiwyd y rhyngweithio â polycations amrywiol ac effaith y broses anwedd ar y cineteg αS yn gyntaf gan y dull adfer fflworoleuedd ar ôl ffotobleaching (FRAP).Fe wnaethon ni brofi coacervates αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau a αS/pLK (100 μM αS wedi'i ategu â 2 μM αS AF488-αS a 100 μM Tau441 neu ΔNtM pL neu ΔNt-TauK).Cafwyd data o fewn y 30 munud cyntaf ar ôl cymysgu'r cydrannau sampl.O ddelweddau cynrychioliadol FRAP (Ffig. 3a, αS/Tau441 anwedd) a'u cromliniau cwrs amser cyfatebol (Ffig. 3b, Atodol Ffig. 3), gellir gweld bod cineteg αS yn debyg iawn i rai coacervates Tau441.a ΔNt-Tau, sy'n llawer cyflymach gyda pLK.Y cyfernodau trylediad wedi'u cyfrifo ar gyfer αS y tu mewn i'r coacervate yn ôl FRAP (fel y disgrifir gan Kang et al. 35) yw D = 0.013 ± 0.009 µm2/s a D = 0.026 ± 0.008 µm2/s ar gyfer α α 4/S ar gyfer 4 α/S a y system αS/.pLK, Tau, a D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, yn y drefn honno (Ffig. 3c).Fodd bynnag, mae'r cyfernod trylediad αS yn y cyfnod gwasgaredig yn nifer o orchmynion maint yn uwch na'r holl gyfnodau cyddwys, fel y'i pennir gan Sbectrosgopeg Cydberthynas Fflworoleuedd (FCS, gweler Ffig Atodol 3) o dan yr un amodau (byffer LLPS) ond yn absenoldeb polycations ( D = 8 ± 4 µm2/s).Felly, mae cineteg cyfieithu αS yn cael ei leihau'n sylweddol mewn coacervates o'i gymharu â phroteinau yn y cyfnod gwasgaredig oherwydd effeithiau gorlenwi moleciwlaidd amlwg, er bod pob coacervates yn cadw eiddo tebyg i hylif yn ystod yr hanner awr cyntaf ar ôl eu ffurfio, mewn cyferbyniad â'r cyfnod tau.cineteg gyflymach mewn cyddwysiad pLK.
a–c Dadansoddiad FRAP o ddeinameg αS (2% â label AF488 αS) mewn coacervates electrostatig.Dangosir delweddau cynrychioliadol o brofion FRAP αS/Tau441 mewn triphlyg yn (a), lle mae cylchoedd coch yn dynodi ardaloedd wedi'u lliwio.Y bar graddfa yw 5 µm.b cromliniau FRAP cyfartalog a (c) cyfernodau trylediad wedi'u cyfrifo (D) ar gyfer 5–6 (N) defnynnau gwahanol o dri arbrawf gan ddefnyddio 100 µM αS a chrynodiadau hafaliadol o Tau441 (coch) neu ΔNt-Tau (glas) neu pLK (gwyrdd) ddeg gwaith y crynodiad o LLPS.Dangosir gwyriad safonol y gromlin FRAP mewn lliw cysgodol.Er mwyn cymharu, pennwyd y cyfernod trylediad αS yn y cyfnod gwasgaredig yn driphlyg gan ddefnyddio sbectrosgopeg cydberthynas fflworoleuedd (FCS) (gweler Ffigur Atodol 3 a dulliau am ragor o wybodaeth).d Sbectra EPR band-X parhaus o 100 μM TEMPOL-122-αS mewn byffer LLPS heb unrhyw amryliw (du) neu ym mhresenoldeb 100 μM Tau441 (coch) neu ΔNt-Tau (glas) neu 1 mM pLK (gwyrdd).Mae'r mewnosodiad yn dangos golwg chwyddedig o'r llinellau cae cryf lle mae'r newidiadau mwyaf dramatig yn digwydd.e Cromliniau rhwymo o 50 μM TEMPOL-122-αS gyda polycations amrywiol yn absenoldeb LLPS (dim PEG).Dangosir bod osgled gostyngol band III o'i gymharu â band II (IIII/III) o'r sbectrwm EPR wedi'i normaleiddio yn cynyddu cymarebau molar Tau441 (coch), ΔNt-Tau (glas) a pLK (gwyrdd).Mae llinellau lliw yn dangos ffit i ddata gan ddefnyddio model rhwymo bras gyda n safleoedd rhwymo union yr un fath ac annibynnol ar bob cromlin.Darperir data crai ar ffurf ffeiliau data crai.
I ategu hyn, fe wnaethom ymchwilio i ddeinameg αS mewn amrywiol coacervates gan ddefnyddio labelu sbin cyfeiriedig (SDSL) a cyseiniant paramagnetig electron parhaus (CW-EPR).Mae'r dull hwn wedi bod yn ddefnyddiol iawn wrth adrodd ar hyblygrwydd a dynameg y CDU gyda datrysiad gweddilliol realistig36,37,38.I'r perwyl hwn, fe wnaethom adeiladu gweddillion cystein mewn mutants Cys sengl a defnyddio'r chwiliedydd troelli 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL).Mae deilliadau Maleimide yn eu labelu.Yn fwy penodol, fe wnaethom fewnosod stilwyr TEMPOL yn safle 122 neu 24 αS (TEMPOL-122-αS a TEMPOL-24-αS).Yn yr achos cyntaf, rydym yn targedu rhanbarth C-terminal y protein, sy'n ymwneud â rhyngweithio â polycations.Yn lle hynny, gall safle 24 roi gwybodaeth i ni am ddeinameg cyffredinol y proteinau yn y cyddwysiad.Yn y ddau achos, roedd y signalau EPR a gafwyd ar gyfer proteinau o'r cyfnod gwasgaredig yn cyfateb i radicalau nitroocsid yn y cyflwr symud cyflym.Ar ôl gwahanu fesul cam ym mhresenoldeb tau neu pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 neu ΔNt-Tau ar gymhareb o 1: 1 neu pLK ar gymhareb o 1:10), gwelwyd cynnydd yn y dwysedd brig cymharol yn sbectrwm EPR αS.Ehangodd y llinell golled, gan ddangos gostyngiad mewn cineteg ailgyfeirio αS mewn defnynnau o'i gymharu â phrotein yn y cyfnod gwanedig (Ffig. 3d, Ffig Atodol 4a).Mae'r newidiadau hyn yn fwy amlwg yn safle 122. Er nad oedd presenoldeb pLK yn safle 24 yn effeithio ar cineteg y stiliwr, yn safle 122 newidiodd siâp y llinell sbectrol yn sylweddol (Ffig Atodol 4a).Pan geisiwyd modelu'r sbectra ar safle 122 o ddwy system αS/amlygu gan ddefnyddio'r model isotropig (Ffigur Atodol 5a) a ddefnyddir yn gyffredin i ddisgrifio deinameg IDP38,39 â label sbin, ni allem ail-greu'r sbectra arbrofol..Efelychiad sbectrol o safle 24 troelliad cyferbyniad (Ffig Atodol 5a).Mae hyn yn awgrymu bod safleoedd ffafriol yn y gofod o ffurfweddau sbin rhanbarth C-terminal o αS ym mhresenoldeb polycations.Wrth ystyried y ffracsiwn o αS yn y cyfnod cyddwys o dan amodau EPR arbrofol (84 ± 2%, 79 ± 7%, a 47 ± 4% ar gyfer αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau, ac αS / pLK, yn y drefn honno - gweler Atodol Ffig. 2e o ddadansoddiad data c), gellir gweld bod yr ehangiad a ganfyddir gan y dull EPR yn adlewyrchu'n bennaf y rhyngweithiad rhwng rhanbarth C-terminal αS â polycations amrywiol yn y cyfnod cyddwys (y prif newid wrth ddefnyddio TEMPOL-122- αS), ac nid anwedd protein.Gwelir cynnydd mewn microviscosity yn y stiliwr.Yn ôl y disgwyl, cafodd sbectrwm EPR y protein o dan amodau heblaw LLPS ei adfer yn llwyr pan ychwanegwyd 1 M NaCl at y cymysgedd (Ffig Atodol 4b).Yn gyffredinol, mae ein data'n awgrymu bod y newidiadau a ganfuwyd gan CW-EPR yn bennaf yn adlewyrchu rhyngweithiad rhanbarth C-terminal αS gyda gwahanol amlhau yn y cyfnod cyddwys, ac ymddengys bod y rhyngweithio hwn yn gryfach gyda pLK na gyda Tau.
Er mwyn cael mwy o wybodaeth strwythurol am y proteinau yn y coacervate, fe benderfynon ni astudio'r system LLPS gan ddefnyddio NMR mewn hydoddiant.Fodd bynnag, dim ond y ffracsiwn αS sy'n weddill yn y cyfnod gwasgaredig y gallem ei ganfod, a allai fod oherwydd llai o ddeinameg protein y tu mewn i'r coacervate a chyfnod trwchus ar waelod yr ateb mewn dadansoddiad NMR.Pan wnaethom ddadansoddi strwythur a dynameg y protein sy'n weddill yng nghyfnod gwasgaredig y sampl LLPS gan ddefnyddio NMR (Ffig Atodol 5c, d), gwnaethom sylwi bod y protein yn ymddwyn bron yn union yr un fath ym mhresenoldeb pLK a ΔNt-Tau, y ddau o a oedd yn strwythur eilaidd a dynameg asgwrn cefn y protein, a ddatgelwyd gan arbrofion ar shifft cemegol eilaidd ac ymlacio R1ρ.Mae data NMR yn dangos bod terfynfa C αS yn dioddef colled sylweddol o hyblygrwydd cydffurfiad tra'n cadw ei natur anhrefnus, fel gweddill y dilyniant protein, oherwydd ei ryngweithio â polycations.
Gan fod yr ehangiad signal CW-EPR a welwyd yng nghyfnod cyddwys TEMPOL-122-αS yn adlewyrchu rhyngweithiad y protein â pholycations, fe wnaethom berfformio titradiad EPR i werthuso affinedd rhwymol αS i amrywiol polycations yn absenoldeb LLPS (dim cronni o Buffer LLPS), sy'n awgrymu bod y rhyngweithiadau yr un fath mewn cyfnodau gwanedig a chrynodol (sy'n cael ei gadarnhau gan ein data, Ffig Atodol 4a a Ffig. Atodol 6).Y nod oedd gweld a yw pob coacervate, er gwaethaf eu priodweddau cyffredin tebyg i hylif, yn arddangos unrhyw ymddygiad gwahaniaethol sylfaenol ar y lefel foleciwlaidd.Yn ôl y disgwyl, ehangodd y sbectrwm EPR gyda chrynodiad cynyddol polycation, gan adlewyrchu gostyngiad mewn hyblygrwydd moleciwlaidd oherwydd rhyngweithiadau moleciwlaidd yr holl bartneriaid rhyngweithio bron i dirlawnder (Ffig. 3e, Atodol Ffig. 6).Cyflawnodd pLK y dirlawnder hwn ar gymhareb molar is (polycation: αS) o'i gymharu â ΔNt-Tau a Tau441.Mewn gwirionedd, dangosodd cymhariaeth o'r data â model rhwymo bras gan dybio bod n safle rhwymo union yr un fath ac annibynnol fod y cysonyn daduniad ymddangosiadol o pLK (~5 μM) yn drefn maint yn is na Tau441 neu ΔNt-Tau (~50 μM). ).µM).Er mai amcangyfrif bras yw hwn, mae hyn yn awgrymu bod gan αS affinedd uwch ar gyfer amlhau symlach â rhanbarthau gwefr bositif parhaus.O ystyried y gwahaniaeth hwn mewn affinedd rhwng αS ac amryliwiadau amrywiol, gwnaethom ragdybio y gallai eu priodweddau hylifol newid yn wahanol dros amser ac felly dioddef o wahanol brosesau LSPT.
O ystyried yr amgylchedd gorlawn iawn o fewn y coacervate protein a natur amyloid y protein, gwelsom ymddygiad y coacervate dros amser i ganfod prosesau LSPT posibl.Gan ddefnyddio microsgopeg BF a CF (Ffigur 4), gwelsom fod αS/Tau441 yn coacervates i raddau helaeth mewn hydoddiant, gan ffurfio defnynnau mawr sy'n cysylltu ac yn gwlychu'r wyneb ar waelod y ffynnon/sleid fel defnynnau llawn, yn ôl y disgwyl (Ffig Atodol .7d) ;rydyn ni'n galw'r strwythurau gwaelod hyn yn “rafftiau protein”.Arhosodd y strwythurau hyn yn hylif gan eu bod yn cadw'r gallu i ffiwsio (Ffig Atodol 7b) a gellid eu gweld am sawl awr ar ôl i'r LLPS gael ei sbarduno (Ffig. 4 a Ffig. Atodol 7c).Gwelsom fod y broses wlychu yn cael ei ffafrio ar wyneb deunyddiau hydroffilig yn hytrach na hydroffobig (Ffig Atodol 7a), yn ôl y disgwyl ar gyfer coacervates electrostatig gyda thaliadau anghytbwys ac felly potensial arwyneb electrostatig uchel.Yn nodedig, αS / ΔNt-Tau cyfuno a rafftio eu gostwng yn sylweddol, tra αS / pLK cyddwysiadau eu gostwng yn sylweddol (Ffig. 4).Yn ystod yr amser magu byr, roedd y defnynnau αS/pLK yn gallu cyfuno a gwlychu'r wyneb hydroffilig, ond daeth y broses hon i ben yn gyflym ac ar ôl 5 awr o ddeori, dim ond digwyddiadau cyfuno cyfyngedig a welwyd ac ni welwyd unrhyw wlychu.- trawsnewid gel-drip.
Cynrychioladol BF (paneli graddfa lwyd) a CF (paneli dde, AF488-label αS mewn gwyrdd) o samplau coacervate yn cynnwys 100 µM αS (label fflworoleuol 1%) mewn byffer LLPS ym mhresenoldeb fflworoleuedd 100 µM Tau441 (top) ΔN microsgopig -Tau (canol) neu 1 mM pLK (gwaelod) ar wahanol adegau deori ac uchder ffocal (z, pellter o waelod y plât yn dda).Ailadroddwyd yr arbrofion 4-6 gwaith yn annibynnol ar ei gilydd gyda'r un canlyniadau.Mae coacervates αS/Tau441 yn cael eu gwlychu ar ôl 24 awr, gan ffurfio rafftiau sy'n fwy na'r ddelwedd.Y bar graddfa ar gyfer pob delwedd yw 20 µm.
Yna gofynnwyd a fyddai'r cronfeydd protein mawr tebyg i hylif a ffurfiwyd yn αS/Tau441 LLPS yn arwain at agregu amyloid o unrhyw un o'r proteinau a astudiwyd.Fe wnaethom ddilyn aeddfediad defnynnau αS/Tau441 dros amser gyda microsgopeg WF o dan yr un amodau ag uchod, ond gan ddefnyddio 1 μM AF488-label αS ac Atto647N-labelu Tau441 (Ffig. 5a).Yn ôl y disgwyl, gwelsom leoleiddio protein cyflawn trwy gydol y broses aeddfedu.Yn ddiddorol, o ca.Ar ôl 5 awr, gwelwyd strwythurau mwy dwys nad ydynt yn gylchol y tu mewn i'r rafftiau, y gwnaethom eu galw'n “bwyntiau”, rhai ohonynt wedi'u cydleoli ag αS, a rhai wedi'u cyfoethogi yn Tau441 (Ffig. 5a, saethau gwyn).Mae'r mannau hyn bob amser wedi'u harsylwi o fewn rafftiau i raddau mwy ar gyfer αS / ΔNt-Tau nag ar gyfer αS / ΔNt-Tau.Nid oedd unrhyw fannau amlwg yn y defnynnau o systemau pLK a Tau nad oeddent yn gymwys ar gyfer ymasiad/gwlychu.Er mwyn profi a yw'r staeniau hyn sy'n cynnwys αS a Tau441 yn agregau tebyg i amyloid, gwnaethom arbrawf tebyg gan ddefnyddio microsgopeg CF lle cafodd Tau441 ei labelu ag Atto647N ac ychwanegwyd thioflavin-T (ThT) amyloid-benodol 12.5 μM o'r dechrau.llifyn.Er na welwyd staenio ThT o ddefnynnau neu rafftiau αS/Tau441 hyd yn oed ar ôl 24 awr o ddeor (Ffig. 5b, rhes uchaf - defnynnau sy'n weddill dros rafftiau protein), roedd strwythurau ThT-positif yn cynnwys Atto647N-Tau441 y tu mewn i'r rafftiau yn wan iawn.mae hyn yn ailadrodd maint, siâp a lleoliad y smotiau a ddisgrifiwyd yn flaenorol (Ffig. 5b, rhesi canol a gwaelod), gan awgrymu y gallai'r smotiau gyfateb i agregau tebyg i amyloid a ffurfiwyd mewn coacervates hylif sy'n heneiddio.
WF 25 μM αS ar wahanol amseroedd deori ac uchder ffocal (z, pellter o'r gwaelod heb ei rwymo) ym mhresenoldeb 25 μM Tau441 (1 μM AF488-label αS ac Atto647N-label Tau441) mewn ffynnon o blât microsgop gyda byffer LLPS) .Ailadroddwyd chwe arbrawf yn annibynnol gyda chanlyniadau tebyg.b Delwedd microsgopig CF o 25 μM αS ym mhresenoldeb 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-labelu Tau441) a 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Dangosir defnynnau protein wedi'u pwysoli a rafftiau protein wedi'u hadneuo a smotiau yn y rhesi uchaf a chanol, yn y drefn honno.Mae'r rhes waelod yn dangos delweddau o rafftiau a diferion o 3 atgynhyrchiad annibynnol.Mae saethau gwyn yn dynodi dotiau ThT-positif yn y ddau banel.Y bar graddfa ar gyfer pob delwedd yw 20 µm.
Er mwyn edrych yn fanylach ar y newidiadau yn y rhwydwaith protein coacervate yn ystod y newid o hylif i solid, defnyddiwyd delweddu oes fflworoleuedd (FLIM) a microsgopeg trosglwyddo egni cyseiniant Förster (FRET) (Ffigur 6 a Ffigurau Atodol 8 a 9).Fe wnaethom ddamcaniaethu bod aeddfedu coacervate yr haen i strwythur protein cyfanredol mwy cyddwys neu hyd yn oed tebyg i solet yn arwain at gysylltiad agosach rhwng y protein a'r stiliwr fflwroleuol sydd ynghlwm wrtho, gan gynhyrchu effaith diffodd o bosibl a amlygir mewn oes stiliwr fyrrach (τ) , fel y disgrifiwyd yn flaenorol40.,41 ,42.Yn ogystal, ar gyfer samplau â label dwbl (AF488 ac Atto647N fel llifynnau rhoddwr a derbynnydd FRET, yn y drefn honno), gall y gostyngiad hwn mewn τ hefyd gyd-fynd ag anwedd coacervate a chynnydd mewn effeithlonrwydd FRET(E) yn ystod LSPT.Fe wnaethom fonitro ffurfiant rafft a sbot dros amser mewn samplau LLPS αS/Tau441 a αS/ΔNt-Tau (25 µM o bob protein mewn byffer LLPS yn cynnwys 1 µM AF488 wedi'i labelu αS a/neu Atto647N wedi'i labelu Tau441 neu ΔNt-Tau).Gwelsom duedd gyffredinol yn yr ystyr bod oes fflworoleuedd y chwiliedyddion AF488 (τ488) ac Atto647N (τ647N) wedi gostwng ychydig wrth i'r coacervates aeddfedu (Ffig. 6 a Ffig. Atodol 8c).Yn ddiddorol, cafodd y newid hwn ei wella'n sylweddol ar gyfer dotiau o fewn rafftiau (Ffig. 6c), sy'n dangos bod anwedd protein pellach wedi digwydd mewn dotiau.I gefnogi hyn, ni welwyd unrhyw newid sylweddol yn oes fflworoleuedd ar gyfer defnynnau αS/ΔNt-Tau 24 h oed (Ffig Atodol. 8d), sy'n awgrymu bod gelation defnynnau yn broses sy'n wahanol i sbotio ac nad yw ad-drefnu moleciwlaidd sylweddol yn cyd-fynd â hynny. o fewn coacervates.Dylid nodi bod gan y dotiau wahanol feintiau a chynnwys amrywiol yn αS, yn enwedig ar gyfer y system αS/Tau441 (Ffig Atodol. 8e).Ynghyd â'r gostyngiad mewn oes fflworoleuedd sbot, cafwyd cynnydd mewn dwyster, yn enwedig ar gyfer Atto647N wedi'i labelu Tau441 (Ffig. Atodol 8a), ac effeithlonrwydd FRET uwch ar gyfer systemau αS/Tau441 ac αS/ΔNt-Tau, sy'n nodi cyddwysiad pellach mewn pum awr LLPS. ar ôl sbarduno, y proteinau y tu mewn i'r trydan statig cyddwyso.O'i gymharu â αS/ΔNt-Tau, gwelsom werthoedd τ647N is a rhywfaint yn uwch τ488 mewn mannau αS/Tau441, ynghyd â gwerthoedd FRET is a mwy anhomogenaidd.O bosibl, gall hyn fod yn gysylltiedig â'r ffaith bod y cyflenwad αS a arsylwyd ac a ddisgwylir mewn agregau yn y system αS/Tau441 yn fwy heterogenaidd, yn aml yn is-stoichiometrig o'i gymharu â Tau, gan y gallai Tau441 ei hun hefyd gael LLPS a chydgrynhoi (Ffig Atodol 8e) .Fodd bynnag, mae graddau'r cyfuniad defnynnau, ffurfiant rafftiau, ac, yn bwysig, agregu protein mewn coacervates tebyg i hylif yn fwyaf posibl pan fydd Tau441 ac αS yn bresennol.
a Delweddau microsgopeg fflworoleuedd Gydol Oes (FLIM) o αS/Tau441 a αS/ΔNt-Tau ar 25 μM o bob protein (1 μM AF488-label αS ac 1 μM Atto647N-label Tau441 neu ΔNT-Tau) mewn bwtyn LLPS-T.Mae'r colofnau'n dangos delweddau cynrychioliadol o samplau LLPS ar wahanol adegau aeddfedu (30 munud, 5 h a 24 h).Mae'r ffrâm goch yn dangos y rhanbarth sy'n cynnwys smotiau αS/Tau441.Dangosir rhychwantau oes fel bariau lliw.Bar graddfa = 20 µm ar gyfer pob delwedd.b Delwedd FLIM wedi'i chwyddo i mewn o'r ardal a ddewiswyd, a ddangosir yn y blwch coch ym mhanel a.Dangosir ystodau bywyd gan ddefnyddio'r un raddfa liw ag ym mhanel a.Bar graddfa = 5 µm.c Histogramau yn dangos AF488 (ynghlwm wrth αS) neu Atto647N (ynghlwm wrth Tau) ar gyfer gwahanol rywogaethau protein (diferion-D-, rafft-R- a brycheuyn-P) a nodwyd mewn delweddau FLIM a gofnodwyd ar gyfer αS-) dosraniadau amseru oes Tau441 a Samplau coacervate αS / ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI ar gyfer D, 29-44 ROI ar gyfer R, a 21-51 ROI ar gyfer pwyntiau).Dangosir gwerthoedd cymedrig a chanolrifol fel sgwariau melyn a llinellau du y tu mewn i flychau, yn y drefn honno.Mae ffiniau isaf ac uchaf y blwch yn cynrychioli'r chwartel cyntaf a'r trydydd chwartel, yn y drefn honno, a dangosir y gwerthoedd isaf ac uchaf o fewn yr ystod rhyngchwartel 1.5-plyg (IQR) fel wisgers.Mae allgleifion yn cael eu dangos fel diemwntau du.Pennwyd arwyddocâd ystadegol rhwng parau o ddosraniadau gan ddefnyddio prawf-t dau sampl, gan dybio amrywiannau anghyfartal.Dangosir gwerthoedd-p prawf-t dwy gynffon gyda seren ar gyfer pob pâr o ddata a gymharir (*gwerth-p> 0.01, ** gwerth-p> 0.001, *** p-value> 0.0001, **** gwerth p > 0.00001), ns Yn dynodi dibwys (gwerth-p> 0.05).Rhoddir yr union werthoedd p yn Nhabl Atodol 1, a chyflwynir y data gwreiddiol fel ffeiliau data crai.
Er mwyn dangos ymhellach natur tebyg i amyloid brycheuyn/agregau, buom yn trin samplau coacervate heb ei staenio am 24 awr gyda chrynodiadau uchel o (1 M) NaCl, a arweiniodd at wahanu agregau oddi wrth geulfannau protein.Pan welwyd agregau ynysig (hy, datrysiad gwasgaredig o agregau) gan ddefnyddio microsgopeg grym atomig (AFM), gwelsom forffoleg sfferig yn bennaf gydag uchder rheolaidd o tua 15 nm, sy'n tueddu i gysylltu o dan amodau crynodiad halen uchel, yn debyg i ymddygiad ffibrilau amyloid nodweddiadol oherwydd yr effaith hydroffobig cryf ar yr wyneb (sylwch fod gan ffibrilau fel arfer uchder o ~10 nm) (Ffig Atodol 10a).Yn ddiddorol, pan ddeorwyd agregau ynysig â ThT mewn asesiad fflworoleuedd ThT safonol, gwelsom gynnydd dramatig mewn cynnyrch cwantwm fflworoleuedd ThT, sy'n debyg i'r hyn a welwyd pan oedd y llifyn wedi'i ddeor â ffibrilau amyloid αS nodweddiadol (Ffig Atodol 10b), sy'n awgrymu bod mae'r agregau coacervate yn cynnwys strwythurau tebyg i amyloid..Mewn gwirionedd, roedd yr agregau yn oddefgar i grynodiadau halen uchel ond yn sensitif i 4 M guanidine clorid (GdnHCl), fel ffibrilau amyloid nodweddiadol (Ffig Atodol 10c).
Nesaf, fe wnaethom ddadansoddi cyfansoddiad yr agregau gan ddefnyddio fflworoleuedd moleciwl sengl, cydberthynas fflworoleuedd penodol / sbectrosgopeg traws-gydberthynas (FCS / FCCS), a dadansoddiad byrstio o ganfod cyd-ddigwyddiad dau liw (TCCD).I'r perwyl hwn, fe wnaethom ynysu agregau a ffurfiwyd ar ôl 24 awr o ddeori mewn 100 μl samplau LLPS yn cynnwys αS a Tau441 (y ddau 25 μM) ynghyd ag 1 μM AF488-labelu αS ac 1 μM Atto647N-labelu Tau441.Gwanhau'r hydoddiant agregau gwasgaredig i gyflwr monomoleciwlaidd gan ddefnyddio'r un byffer di-PEG ac 1 M NaCl (yr un byffer a ddefnyddir i wahanu agregau oddi wrth coacervate) i atal unrhyw ryngweithio electrostatig posibl rhwng LLPS a phrotein.Mae enghraifft o lwybr amser moleciwl sengl i'w gweld yn Ffig. 7a.Dangosodd dadansoddiad FCCS/FCS (traws-gydberthynas, CC ac awtgydberthynas, AC) fod agregau sy'n cynnwys αS a tau yn helaeth yn y samplau (gweler cromlin CC yn Ffig. 7b, panel chwith), a chododd gormodedd o brotein monomerig gweddilliol fel a canlyniad y broses wanhau (gweler cromliniau AC yn Ffigur 7b, panel chwith).Nid oedd arbrofion rheoli a berfformiwyd o dan yr un amodau datrysiad gan ddefnyddio samplau a oedd yn cynnwys proteinau monomerig yn unig yn dangos unrhyw gromliniau CC, ac mae'r cromliniau AC yn cyd-fynd yn dda â'r model trylediad un-gydran (Eq. 4), lle mae gan broteinau monomerig y cyfernodau tryledu disgwyliedig (Ffig. 7b ), panel dde).Mae cyfernod trylediad gronynnau agregedig yn llai nag 1 µm2/s, ac mae cyfernod trylediad proteinau monomerig tua 1 µm2/s.50–100 µm/s;mae gwerthoedd yn debyg i werthoedd a gyhoeddwyd yn flaenorol ar gyfer ffibrilau amyloid sonicated αS a αS monomerig ar wahân o dan amodau datrysiad tebyg44.Pan wnaethom ddadansoddi'r agregau gyda dadansoddiad ffrwydrad TCCD (Ffig. 7c, panel uchaf), canfuom fod tua 60% o'r agregau a ganfuwyd yn cynnwys αS a tau ym mhob agreg ynysig (αS/Tau heteroaggregate), yn cynnwys αS a tau yn unig. tau, tua 10% αS yn unig.Dangosodd dadansoddiad stoichiometrig o heteroaggregau αS/Tau fod y rhan fwyaf o'r heteroaggregau wedi'u cyfoethogi mewn tau (stoichiometreg o dan 0.5, mae nifer cyfartalog y moleciwlau tau fesul agreg 4 gwaith yn fwy na moleciwlau αS), sy'n gyson â'n gwaith a arsylwyd yn FLIM in situ arbrofion..Dangosodd dadansoddiad FRET fod yr agregau hyn yn cynnwys y ddau brotein, er nad yw'r gwerthoedd FRET gwirioneddol yn yr achos hwn o bwysigrwydd mawr, gan fod dosbarthiad fflworofforau ym mhob agregau ar hap oherwydd gormodedd o brotein heb ei labelu a ddefnyddiwyd yn yr arbrawf.Yn ddiddorol, pan wnaethom berfformio'r un dadansoddiad gan ddefnyddio'r amrywiad Tau agregu amyloid aeddfed 45,46 (gweler Ffig Atodol 11a, b), gwnaethom sylwi, er bod agregiad electrostatig αS yr un peth (Ffig Atodol 11c, d), lleihawyd y gallu i ffurfio agregau o fewn y coacervate yn sylweddol a chanfu FLIM sawl smotyn mewn arbrofion in situ, a gwelwyd cromliniau croes-gydberthynas gwan ar gyfer samplau agregau ynysig.Fodd bynnag, ar gyfer nifer fach o agregau a ganfuwyd (dim ond un rhan o ddeg o Tau441), gwelsom fod pob agreg wedi'i gyfoethogi yn αS na'r amrywiad Tau hwn, gyda thua 50% o'r agregau a ganfuwyd yn cynnwys moleciwlau αS yn unig, ac roedd αS yn heterogenaidd mewn gormodedd. .agregau (gweler Ffig. Atodol 11e), yn wahanol i'r agregau heterogenaidd a gynhyrchir gan Tau441 (Ffig. 6f).Dangosodd canlyniadau'r arbrofion hyn, er bod αS ei hun yn gallu cronni gyda tau o fewn y coacervate, mae cnewyllyn tau yn fwy ffafriol o dan yr amodau hyn, ac mae'r agregau tebyg i amyloid sy'n deillio o hyn yn gallu gweithredu fel ffurf o αS a tau.Fodd bynnag, unwaith y bydd craidd tau-gyfoethog yn cael ei ffurfio, mae rhyngweithiadau heteroteipig rhwng αS a tau yn cael eu ffafrio mewn agregau dros ryngweithio homotypic rhwng moleciwlau tau;rydym hefyd yn arsylwi rhwydweithiau protein mewn coacervates hylif αS/tau.
a fflworoleuedd Cynrychioliadol olion tymhorol moleciwlau sengl o agregau ynysig a ffurfiwyd mewn coacervates electrostatig αS/Tau441.Gwelwyd pyliau sy'n cyfateb i geuladau αS/Tau441 (pyliau uwchlaw'r trothwy a nodwyd) mewn tair sianel ganfod (allyriadau AF488 ac Atto647N ar ôl cyffro uniongyrchol, llinellau glas a choch, allyriadau Atto647N ar ôl cyffro anuniongyrchol), FRET, llinell fioled).b Dadansoddiad FCS/FCCS o sampl o agregau αS/Tau441 ynysig a gafwyd gan LLPS (panel chwith).Dangosir cromliniau awto-gydberthynas (AC) ar gyfer AF488 ac Atto647N mewn glas a choch, yn y drefn honno, a dangosir cromliniau croes-gydberthynas (CC) sy'n gysylltiedig ag agregau sy'n cynnwys y ddau liw mewn porffor.Mae'r cromliniau AC yn adlewyrchu presenoldeb rhywogaethau monomerig a phrotein cyfanredol wedi'u labelu, tra bod cromliniau CC yn dangos trylediad agregau â label dwbl yn unig.Yr un dadansoddiad, ond o dan yr un amodau datrysiad ag mewn mannau ynysig, dangosir samplau sy'n cynnwys αS monomerig a Tau441 yn unig fel rheolaethau yn y panel cywir.c Dadansoddiad fflach fflworoleuedd o foleciwlau sengl o agregau ynysig a ffurfiwyd mewn coacervates electrostatig αS/Tau441.Mae gwybodaeth ar gyfer pob agreg a geir mewn pedwar ailadroddiad gwahanol (N = 152) yn cael ei blotio yn erbyn eu stoichiometry, gwerthoedd S, ac effeithlonrwydd FRET (panel uchaf, bar lliw yn adlewyrchu digwyddiad).Gellir gwahaniaethu rhwng tri math o agregau: -αS-yn-unig agregau gyda S~1 a FRET~0, agregau Tau yn unig gyda S~0 a FRET~1, ac agregau heterogenaidd Tau/αS gyda S~1 a FRET~0 canolradd Amcangyfrifon o'r swm o'r ddau brotein marcio a ganfuwyd ym mhob agreg heterogenaidd (N = 100) yn cael eu dangos yn y panel isaf (mae'r raddfa lliw yn adlewyrchu'r digwyddiad).Darperir data crai ar ffurf ffeiliau data crai.
Adroddwyd bod aeddfedu neu heneiddio cyddwysiadau protein hylifol yn strwythurau tebyg i gel neu solet dros amser yn ymwneud â nifer o swyddogaethau ffisiolegol y cyddwysiad47 yn ogystal â chlefyd, fel proses annormal cyn cydgrynhoi amyloid 7, 48, 49. Yma rydym yn astudio gwahaniad cyfnod ac ymddygiad yn fanwl.LSPT αS ym mhresenoldeb polycations ar hap mewn amgylchedd rheoledig ar grynodiadau micromolar isel ac amodau ffisiolegol berthnasol (sylwch mai crynodiad ffisiolegol cyfrifedig αS yw >1 µM50), yn dilyn ymddygiad nodweddiadol LPS a yrrir gan thermodynamig.Canfuom fod αS, sy'n cynnwys rhanbarth terfynell C â gwefr negyddol iawn ar pH ffisiolegol, yn gallu ffurfio defnynnau llawn protein mewn hydoddiant dyfrllyd trwy LLPS ym mhresenoldeb peptidau ag anhwylder cationig iawn fel pLK neu Tau trwy'r broses electrostatig. anwedd cymhleth ym mhresenoldeb macromoleciwlau agregu.Gall y broses hon gael effeithiau perthnasol yn yr amgylchedd cellog lle mae αS yn dod ar draws gwahanol foleciwlau polycationig sy'n gysylltiedig â'i agregu sy'n gysylltiedig â chlefydau in vitro ac in vivo51,52,53,54.
Mewn llawer o astudiaethau, mae deinameg protein o fewn defnynnau wedi'i ystyried fel un o'r ffactorau allweddol sy'n pennu'r broses aeddfedu55,56.Yn electrostatig αS coacervates â polycations, mae'r broses aeddfedu yn ôl pob golwg yn dibynnu ar gryfder y rhyngweithio â polycations, y falens, a lluosogrwydd y rhyngweithiadau hyn.Mae damcaniaeth ecwilibriwm yn awgrymu mai tirwedd ecwilibriwm o ddau gyflwr hylifol fyddai presenoldeb defnyn mawr sy’n gyfoethog mewn biopolymerau sy’n gyrru LLPS57,58.Gellir cyflawni twf defnynnau trwy aeddfedu Ostwald59, cyfuniad60 neu ddefnyddio monomer rhydd yn y cyfnod gwasgaredig61.Ar gyfer αS a Tau441, ΔNt-Tau neu pLK, roedd y rhan fwyaf o'r protein wedi'i grynhoi yn y cyddwysiad o dan yr amodau a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon.Fodd bynnag, er bod defnynnau tau maint llawn yn cyfuno'n gyflym ar wlychu'r wyneb, roedd cyfuno defnynnau a gwlychu yn anodd i ΔNt-Tau a pLK, gan awgrymu colled cyflym o briodweddau hylif yn y ddwy system hyn.Yn ôl ein dadansoddiad FLIM-FRET, roedd y defnynnau pLK ac ΔNt-Tau oed yn dangos graddau tebyg o agregu protein (oes fflworoleuedd tebyg) â’r defnynnau gwreiddiol, sy’n awgrymu bod y rhwydwaith protein gwreiddiol yn cael ei gadw, er ei fod yn fwy anhyblyg.
Rydym yn rhesymoli ein canlyniadau arbrofol yn y model canlynol (Ffigur 8).Mae'r defnynnau a ffurfiwyd dros dro i ddechrau yn aml yn rwydweithiau protein heb iawndal electrostatig, ac felly mae meysydd o anghydbwysedd tâl, yn enwedig ar y rhyngwyneb defnyn, gan arwain at ddefnynnau â photensial arwyneb electrostatig uchel.Er mwyn gwneud iawn am wefriad (ffenomen y cyfeirir ati'n gyffredin fel disbyddiad falens) a lleihau potensial arwyneb y defnynnau, gall y defnynnau gynnwys polypeptidau newydd o'r cyfnod gwanedig, ad-drefnu rhwydweithiau protein i wneud y gorau o ryngweithio gwefr, a rhyngweithio â defnynnau eraill.gydag arwynebau (gwlychu).Mae'n ymddangos bod y defnynnau αS/pLK, oherwydd eu rhwydwaith protein symlach (dim ond rhyngweithiadau heteroteipig rhwng αS a pLK) a mwy o affinedd ar gyfer rhyngweithiadau protein-protein, yn gallu cydbwyso gwefr y cyddwysiad yn gyflymach;yn wir, gwelsom cineteg protein cyflymach mewn coacervates αS/pLK a ffurfiwyd i ddechrau nag yn αS/Tau.Ar ôl disbyddu falens, mae'r rhyngweithiadau'n mynd yn llai byrhoedlog ac mae'r defnynnau'n colli eu priodweddau hylifol ac yn troi'n ddefnynnau anfflamadwy tebyg i gel gyda photensial arwyneb electrostatig isel (ac felly'n methu â gwlychu'r wyneb).Mewn cyferbyniad, mae defnynnau αS / Tau yn llai effeithlon wrth optimeiddio cydbwysedd tâl defnynnau oherwydd rhwydweithiau protein mwy cymhleth (gyda rhyngweithiadau homotypic a heteroteipig) a natur wannach rhyngweithiadau protein.Mae hyn yn arwain at ddefnynnau sy'n cadw ymddygiad hylif am gyfnodau estynedig o amser ac yn arddangos potensial arwyneb electrostatig uchel sy'n tueddu i gael ei leihau trwy gyfuno a thyfu (a thrwy hynny leihau cymhareb arwynebedd arwyneb / cyfaint y defnynnau) a thrwy wlychu'r cemeg arwyneb hydroffilig.Mae hyn yn creu llyfrgelloedd protein dwys mawr sy'n cadw priodweddau hylif gan fod y rhyngweithiadau'n parhau'n fyrhoedlog iawn oherwydd y chwiliad cyson am optimeiddio tâl yn y rhwydwaith protein.Yn ddiddorol, mae ffurfiau Tau sydd wedi'u cwtogi'n derfynol gan N, gan gynnwys rhai isoformau62 sy'n digwydd yn naturiol, yn arddangos ymddygiad canolraddol, gyda rhai coacervates heneiddio gyda αS i mewn i ddefnynnau hirhoedlog tebyg i gel, tra bod eraill yn trawsnewid i gyddwysiadau hylif mawr.Mae'r ddeuoliaeth hon wrth aeddfedu coacervates electrostatig αS yn gyson ag astudiaethau damcaniaethol ac arbrofol diweddar LLPS sydd wedi nodi cydberthynas rhwng disbyddiad falens a hidlo electrostatig mewn cyddwysiadau fel allwedd i reoli maint cyddwysiad a phriodweddau hylif.Mecanwaith 58.61.
Mae'r cynllun hwn yn dangos y llwybr agregu amyloid tybiedig ar gyfer αS a Tau441 trwy LLPS a LSPT.Gyda rhanbarthau ychwanegol cyfoethog anion (coch) a cation (glas), mae coacervates electrostatig αS a tau gyda falens boddhaol yn meddu ar ynni arwyneb is ac felly llai o gyfuno, gan arwain at heneiddio defnynnau cyflym.Cyflawnir cyflwr gel sefydlog heb grynhoad..Mae'r sefyllfa hon yn ffafriol iawn yn achos y system αS/pLK oherwydd ei affinedd uwch a'i rhwydwaith rhyngweithio pâr protein symlach, sy'n caniatáu trawsnewidiad cyflym tebyg i gel.I'r gwrthwyneb, mae defnynnau â falens anfoddhaol ac, felly, rhanbarthau â gwefr brotein ar gael ar gyfer rhyngweithio, yn ei gwneud hi'n haws i'r coacervate ffiwsio a gwlychu'r wyneb hydroffilig er mwyn lleihau ei egni arwyneb uchel.Mae'r sefyllfa hon yn well ar gyfer coacervates αS/Tau441, sydd â rhwydwaith cymhleth aml-falent sy'n cynnwys rhyngweithiadau Tau-Tau a αS-Tau gwan.Yn eu tro, bydd coacervates mwy yn cadw eu priodweddau tebyg i hylif yn haws, gan ganiatáu i ryngweithio protein-i-brotein ddigwydd.Yn y pen draw, mae agregau heterogenaidd amyloid sy'n cynnwys αS a tau yn ffurfio o fewn yr hylif coacervate, a all fod yn gysylltiedig â'r rhai a geir mewn cyrff cynhwysiant, sy'n nodweddion clefydau niwroddirywiol.
Mae'r strwythurau mawr tebyg i hylif a ffurfiwyd yn ystod aeddfedu αS/Tau441 gydag amgylchedd protein llawn tagfeydd ond deinamig ac, i raddau llai, coacervates αS/ΔNt-Tau yn gronfeydd dŵr delfrydol ar gyfer cnewyllo agregu protein.Rydym yn wir wedi arsylwi ar ffurfio agregau protein solet yn y math hwn o coacervates protein, yn aml yn cynnwys αS a tau.Rydym wedi dangos bod yr heteroaggregau hyn yn cael eu sefydlogi gan ryngweithiadau anelectrostatig, yn gallu rhwymo llifynnau ThT amyloid-benodol yn yr un modd â ffibrilau amyloid nodweddiadol, ac yn wir mae ganddynt wrthwynebiad tebyg i ddylanwadau amrywiol.Dangoswyd bod gan yr agregau αS/tau a ffurfiwyd gan LLPS briodweddau tebyg i amyloid.Yn wir, mae'r amrywiad aeddfed o Tau sy'n ddiffygiol mewn agregu amyloid yn cael ei amharu'n sylweddol wrth ffurfio'r agregau αS heterogenaidd hyn o fewn y coacervate electrostatig hylif.Dim ond y tu mewn i'r coacervates y gwelwyd ffurfio agregau αS/Tau441, a oedd yn cadw eiddo tebyg i hylif, a byth, pe na bai'r coacervates / defnynnau yn cyrraedd y cyflwr gel.Yn yr achos olaf, mae cryfder cynyddol rhyngweithiadau electrostatig ac, o ganlyniad, anhyblygedd y rhwydwaith protein yn atal yr ad-drefniadau cydffurfiadol angenrheidiol o broteinau i sefydlu rhyngweithiadau protein newydd sy'n angenrheidiol ar gyfer cnewyllyn amyloid.Fodd bynnag, gellir cyflawni hyn mewn coacervates mwy hyblyg, tebyg i hylif, sydd yn eu tro yn fwy tebygol o aros yn hylif wrth iddynt gynyddu mewn maint.
Mae'r ffaith bod ffurfio agregau o fewn y cyfnod cyddwys yn well mewn cyddwysiadau αS/Tau mawr nag mewn defnynnau bach sy'n gelu'n gyflym, yn amlygu perthnasedd nodi'r ffactorau sy'n rheoli cyddwysiad defnynnau.Felly, nid yn unig mae tueddiad i wahanu fesul cam, ond mae'n rhaid rheoli maint y cyddwysiad er mwyn iddo weithredu'n iawn yn ogystal ag atal clefydau58,61.Mae ein canlyniadau hefyd yn amlygu pwysigrwydd y cydbwysedd rhwng LLPS a LSPT ar gyfer y system αS/Tau.Er y gall ffurfio defnynnau amddiffyn rhag agregu amyloid trwy leihau faint o fonomerau protein sydd ar gael o dan amodau dirlawnder, fel y cynigiwyd mewn systemau eraill63,64, gall ymasiad defnynnau ar lefelau defnynnau uchel arwain at agregu protein mewnol trwy ad-drefnu cydffurfiad araf.rhwydweithiau protein..
Yn gyffredinol, mae ein data yn pwysleisio’n gryf pa mor berthnasol yw falens cydlynol a rhyngweithiadau bodlon/anfodlon mewn rhwydweithiau gollwng yng nghyd-destun LSPT.Yn benodol, rydym yn dangos bod cyddwysiadau αS/Tau441 hyd llawn yn gallu asio a chnewyllo'n effeithlon i ffurfio heteroaggregau tebyg i amyloid sy'n cynnwys proteinau ac yn cynnig mecanwaith moleciwlaidd yn seiliedig ar ein canlyniadau arbrofol.Mae’n bosibl bod cydgasglu dau brotein yn y coacervate hylif αS/Tau yr ydym yn adrodd yma yn wir yn gysylltiedig â chydleoli dau brotein mewn cynhwysiant, sy’n nodweddion y clefyd, a gallai gyfrannu at ddeall y berthynas rhwng LLPS a agregu amyloid, gan baratoi'r ffordd ar gyfer CDU â gwefr uchel mewn niwroddirywiad.
Mynegwyd amrywiadau monomerig WT-αS, cystein mutants (Q24C-αS, N122C-αS) ac amrywiadau ΔCt-αS (Δ101-140) yn E. coli a'u puro fel y disgrifiwyd yn flaenorol.Roedd 5 mM DTT wedi'i gynnwys ym mhob cam wrth buro mutants cystein αS i atal ffurfio bond disulfide.Tau441 isoform (plasmid a gafwyd o Addgene #16316), amrywiad ΔNt-Tau (Δ1–150, a gafwyd trwy glonio IVA gyda paent preimio CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTCTTTAAAGTTAAAC) ac AggDef-Tau 1 purified, ac AggDef-Tau 5 primer, 1-150 purified diwylliannau coli oedd wedi'i dyfu i OD600 = 0.6-0.7 ar 37 ° C a 180 rpm, a ysgogwyd mynegiant gydag IPTG am 3 awr ar 37 ° C.Cynaeafu celloedd ar 11,500 xg am 15 munud ar 4 ° C a'u golchi â byffer halwynog sy'n cynnwys 150 mM NaCl.Ail-ddarparu'r pelen mewn byffer lysis (20 ml fesul 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidin 50 μM, copeptin 10).Perfformiwyd y cam sonication ar rew gydag osgled o 80% am 10 corbys (1 munud ymlaen, 1 munud i ffwrdd).Peidiwch â bod yn fwy na 60 ml mewn un uwchsain.Cynheswyd lysates E. coli ar 95° C. am 20 munud, yna eu hoeri ar rew a'u centrifugio ar 127,000 × g am 40 munud.Rhoddwyd yr uwchnatant clir ar bilen 3.5 kDa (Spectrwm™ Thermo Fisher Scientific, DU) a'i ddialysis yn erbyn 4 L o glustogfa dialysis (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0.1 mM) am 10 awr.Cafodd colofn cyfnewid cation 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, UDA) ei gydbwyso â byffer equilibration (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Cafodd y tau lysate ei hidlo trwy hidlydd PVDF 0.22 μm a'i chwistrellu i'r golofn ar gyfradd llif o 1 ml/munud.Cynhaliwyd elution yn raddol, cafodd tau ei osgoi gyda byffer elution 15-30% (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Dadansoddwyd ffracsiynau gan SDS-PAGE, a chrynhowyd unrhyw ffracsiynau a oedd yn cynnwys un band gyda'r pwysau moleciwlaidd disgwyliedig tau gan ddefnyddio hidlydd centrifuge 10 kDa a gosod byffer yn eu lle yn cynnwys 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM a DTT 2 mM ar gyfer y crynodiad protein terfynol oedd 100 μM.Yna cafodd yr hydoddiant protein ei basio trwy hidlydd PVDF 0.22 μm, ei rewi'n gyflym a'i storio ar -80 ° C.Darparwyd Protein K18 yn garedig gan yr Athro Alberto Boffi.Purdeb y paratoad oedd >95% fel y cadarnhawyd gan SDS-PAGE a MALDI-TOF/TOF.Cafodd amryw o gysteinau eu labelu'n gemegol gyda AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, UDA) neu TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).eu cadarnhau gan amsugnedd a MALDI-TOF/TOF.Cafodd Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau a K18 eu labelu â gweddillion cystein brodorol yn safleoedd 191 a 322 gan ddefnyddio Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, yr Almaen) yn dilyn yr un weithdrefn.Cynhyrchwyd tâl net fesul mapiau gweddillion ar gyfer αS a Tau441 gan ddefnyddio CIDER66.
Solid poly-L-lysin (pLK DP 90-110 yn ôl NMR gan gyflenwr, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, UDA) ei ddiddymu yn 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 i 10 mM crynodiad, proses sonicated ar gyfer 5 munudau mewn baddon dŵr ultrasonic a'i storio ar -20 ° C.Mae PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, UDA) a FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, UDA) yn hydawdd mewn dŵr ac wedi'u dosbarthu'n eang mewn byffer LLPS.Mae dialysis yn cael gwared ar halwynau halogedig.Yna cawsant eu hidlo trwy hidlydd chwistrell gyda maint mandwll o 0.22 μm, a chyfrifwyd eu crynodiadau gan ddefnyddio reffractomedr (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, UDA).Paratowyd samplau LLPS ar dymheredd ystafell yn y drefn ganlynol: cymysgwyd byffer ac allwthio ac 1 mM tris(2-carboxyethyl)ffosffin (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethan-(Ethan-). 1, 2-diyldinitrile) asid tetraacetig (EDTA, carboxynth) a chymysgedd o atalydd proteas 1% (PMSF 100 mM, bensimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Yna αS a polycations ymdoddedig (opsiynau pLK neu Tau) yn cael eu hychwanegu.Ar gyfer arbrofion cyfres amser thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), defnyddiwch gyfanswm y crynodiad ThT i fod yn hanner y crynodiad αS.Cymysgwch y samplau'n ysgafn ond yn drylwyr i sicrhau eu bod yn homogenaidd.Roedd crynodiad pob cydran yn amrywio o arbrawf i arbrawf, fel y disgrifir yn yr adran Canlyniadau.Defnyddiwyd Asid mewn crynodiad o 0.02% (w/v) pryd bynnag yr oedd hyd yr arbrawf yn fwy na 4 awr.Ar gyfer pob dadansoddiad sy'n defnyddio samplau LLPS, caniatewch i'r cymysgedd gydbwyso am 5 munud cyn ei ddadansoddi.Ar gyfer dadansoddiad gwasgariad golau, llwythwyd 150 µl o samplau ar ficroblatiau 96-ffynnon nad oeddent yn rhwymo (µClear®, du, F-Bottom/Ffynnon Simnai, bio-un Greiner, Kremsmünster, Awstria) a'u gorchuddio â ffilm gludiog.Cafodd PACau eu monitro trwy fesur amsugnedd ar 350 nm yng nghanol yr ateb mewn darllenydd plât CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, yr Almaen).Cynhaliwyd yr arbrofion mewn triphlyg ar 25°C, a chyfrifwyd y gwallau fel y gwyriad safonol o'r cymedr.Mesurwyd y cyfnod gwanedig trwy allgyrchu sampl a dadansoddiad gel SDS-PAGE, a mesurwyd y ffracsiwn αS yn y cyfnodau gwanedig a chrynodedig mewn amrywiol atebion LLPS.Paratowyd sampl LLPS 100 μl yn cynnwys 1 μM AF488-label αS trwy gymysgu trylwyr ac yna allgyrchu ar 9600 × g am 30 munud, ac ar ôl hynny roedd y gwaddod yn weladwy fel arfer.Defnyddiwyd y 50 μl uchaf o'r uwchnatant ar gyfer meintioli protein gan ddefnyddio gel SDS-PAGE.Cafodd geliau eu sganio â ffilterau AF488 gan ddefnyddio system delweddu gel ChemiDoc (Labordai Bio-Rad, Hercules, CA, UDA) neu eu staenio â staen Coomassie a'u delweddu â hidlwyr priodol.Dadansoddwyd y bandiau canlyniadol gan ddefnyddio fersiwn ImageJ 1.53i (Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol, UDA).Cynhaliwyd yr arbrofion yn ddyblyg mewn dau arbrawf gwahanol gyda chanlyniadau tebyg.
Yn nodweddiadol, cymhwyswyd 150 μl o samplau ar ficroblatiau 96-ffynnon nad oeddent yn rhwymol a'u delweddu ar dymheredd ystafell ar ficrosgop gwrthdro Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, yr Almaen).Ar gyfer arbrofion yn y fan a'r lle, defnyddiwyd platiau Angiogenesis µ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, yr Almaen) neu ficroblatiau polystyren 96-ffynnon (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) hefyd.Defnyddiwyd lampau halid metel halogen neu fercwri EL6000 fel ffynonellau goleuo (ar gyfer delweddu BF/DIC a WF, yn y drefn honno).Ar gyfer microsgopeg WF, defnyddiwyd amcan chwyddo aer 40x (Leica Microsystems, yr Almaen) i ganolbwyntio'r golau ar y sampl a'i gasglu.Ar gyfer samplau AF488 a ThT wedi'u labelu, hidlo cyffro ac allyriadau gyda setiau hidlo GFP safonol, hidlwyr llwybr band cynhyrfu ac allyriadau, yn y drefn honno, hidlwyr pas band 460-500 nm a 512-542 nm, a drych deucroig 495 nm.Ar gyfer samplau sydd wedi'u labelu ag Atto647N, defnyddiwyd set safonol o hidlwyr Cy5 gyda hidlwyr bandpass excitation ac allyriadau 628-40 nm a 692-40 nm, yn y drefn honno, a drych deucroig 660 nm.Ar gyfer microsgopeg BF a DIC, defnyddiwch yr un amcan casglu golau adlewyrchiedig.Recordiwyd y golau a gasglwyd ar gamera CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, yr Almaen).Yr amser datguddio oedd 50 ms ar gyfer delweddu microsgopeg BF a DIC a 20-100 ms ar gyfer delweddu microsgopeg WF.Er mwyn cymharu, yr amser datguddio ar gyfer pob arbrawf gyda ThT oedd 100 ms.Perfformiwyd arbrofion treigl amser i ddelweddu cyfuniad defnynnau, gyda delweddau'n cael eu casglu bob 100 ms am sawl munud.Defnyddiwyd ImageJ (NIH, UDA) ar gyfer dadansoddi delweddau.Cynhaliwyd yr arbrofion yn driphlyg gyda chanlyniadau tebyg.
Ar gyfer arbrofion cydleoli, ail-greu FRAP a 3D, cafwyd delweddau ar ficrosgop confocal gwrthdro Zeiss LSM 880 gan ddefnyddio argraffiad glas ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, yr Almaen).Rhoddwyd samplau o 50 µl ar ddysglau µ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, yr Almaen), wedi'u trin â pholymer hydroffilig (ibiTreat) a'u gosod mewn amcan trochi olew 63 × (Plan-Apochromat 63 × / NA 1.4 Oil) ar DIC).Cafwyd delweddau gan ddefnyddio llinellau laser argon 458 nm, 488 nm, a 633 nm gyda chydraniad o 0.26 µm / picsel ac amser datguddio o 8 µs / picsel ar gyfer ffenestri cyffroi a chanfod allyriadau o 470-600 nm, 493-628 nm, a defnyddiwyd 638-755 nm i ddelweddu ThT, AF488 ac Atto647N, yn y drefn honno.Ar gyfer yr arbrofion FRAP, cofnodwyd ffotograffiaeth treigl amser o bob sampl ar 1 ffrâm yr eiliad.Cynhaliwyd yr arbrofion yn driphlyg ar dymheredd ystafell gyda chanlyniadau tebyg.Dadansoddwyd yr holl ddelweddau gan ddefnyddio meddalwedd argraffiad glas Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, yr Almaen).Cafodd cromliniau FRAP eu normaleiddio, eu plotio a'u gosod ar ddata dwyster / amser a dynnwyd o ddelweddau gan ddefnyddio Zen 2 gan ddefnyddio OriginPro 9.1.Gosodwyd y cromliniau adfer i fodel mono-esbonyddol i gyfrif am drylediad moleciwlaidd gyda therm esbonyddol ychwanegol i gyfrif am yr effaith cannu caffael.Yna fe wnaethom gyfrifo D gan ddefnyddio'r radiws cannu nominal a'r hanner oes adfer a bennwyd yn flaenorol fel yn hafaliad Kang et al.5 35 a ddangosir.
Cafodd amrywiadau cystein sengl o αS eu syntheseiddio â 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) mewn swyddi 24 (TEMPOL-24-αS) a 122 (TEMPOL-122-αS), yn y drefn honno.Labelu Sbin Ar gyfer arbrofion EPR, gosodwyd y crynodiad αS ar 100 μM a'r crynodiad PEG oedd 15% (w/v).Ar gyfer amodau agregu amrywiol, y gymhareb αS:pLK oedd 1:10, tra bod y cymarebau αS: ΔNt-Tau a αS:Tau441 yn cael eu cynnal ar 1:1.Ar gyfer arbrofion titradiad rhwymol yn absenoldeb gorlenwi, cynhaliwyd TEMPOL-122-αS ar 50 μM a chafodd polycations eu titradu ar grynodiadau cynyddol, gan baratoi pob cyflwr ar wahân.Cynhaliwyd mesuriadau CW-EPR gan ddefnyddio sbectromedr band X Bruker ELEXSYS E580 gyda chyseinydd Bruker ER4118 SPT-N1 yn gweithredu ar amledd microdon (SHF) o ~9.7 GHz.Gosodwyd y tymheredd ar 25 ° C a'i reoli gan cryostat nitrogen hylifol.Cafwyd y sbectra o dan amodau annirlawn ar bŵer MW o 4 mW, osgled modiwleiddio o 0.1 mT, ac amledd modiwleiddio o 100 kHz.Cafodd dwyster sbectrol eu normaleiddio i osgoi gwahaniaethau mewn crynodiadau sbin rhwng samplau a gostyngiad sbin posibl oherwydd crynodiadau gweddilliol o asiantau lleihau mewn samplau sy'n cynnwys Tau441 neu ΔNt-Tau (yn bresennol yn yr atebion protein gwreiddiol).Cafwyd y gwerthoedd a roddwyd o g o ganlyniad i fodelu sbectrol EPR a berfformiwyd gan ddefnyddio meddalwedd Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) a weithredwyd yn Matlab®67.Defnyddiwyd modelau isotropig un/dwy gydran i fodelu'r data.Ar ôl normaleiddio'r holl signalau, cyfrifwyd y gweddillion trwy dynnu pob efelychiad o'r sbectrwm arbrofol cyfatebol.Ar gyfer dadansoddiad titradiad rhwymol, defnyddiwyd dwyster cymharol y trydydd band i ail fand y sbectrwm EPR normaleiddio (IIII/III) i fonitro rhwymiad polycations i αS.I amcangyfrif y cysonyn daduniad (Kd), gosodwyd y gromlin ganlyniadol i fodel bras gan dybio n safleoedd rhwymo union yr un fath ac annibynnol.
Cynhaliwyd arbrofion sbectrosgopeg NMR gan ddefnyddio sbectromedr NMR Bruker Neo 800 MHz (1H) gyda cryoprobe a graddiant Z.Perfformiwyd yr holl arbrofion gan ddefnyddio 130-207 µM αS a αS / ΔNt-Tau cyfatebol a phLK cyfatebol mewn 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ac fe'u perfformiwyd ar 15 ° C.Er mwyn monitro LPS yn ôl NMR, ychwanegwyd 10% PEG at y samplau cyn-gymysg.Mae'r plot aflonyddiad shifft cemegol (Ffig. 1b) yn dangos y sifftiau cemegol 1H a 15N ar gyfartaledd.Neilltuwyd sbectra αS 2D1H-15N HSQC yn seiliedig ar aseiniad blaenorol (cofnod BMRB #25227) a'u cadarnhau trwy gofnodi a dadansoddi sbectra 3D HNCA, HNCO a CBCAcoNH.Cyfrifwyd sifftiau cemegol 13Cα a 13Cβ ym mhresenoldeb ΔNt-Tau neu pLK i fesur newidiadau posibl mewn tueddiadau strwythur eilaidd o'i gymharu â sifftiau cemegol αS mewn cydffurfiad coil ar hap pur 68 (Ffigur Atodol 5c).Mesurwyd y cyfraddau R1ρ trwy gofnodi arbrofion hsqctretf3gpsi (a gafwyd o lyfrgell Bruker) gydag oedi o 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, ac 800 ms, ac addaswyd y swyddogaethau esbonyddol i'r oedi dwysedd brig ar wahanol adegau. amseroedd i bennu'r R1ρ a'i ansicrwydd arbrofol.
Perfformiwyd arbrofion microsgopeg fflworoleuedd dau-liw wedi'u datrys gan amser ar ficrosgop cydffocal fflworoleuedd MT200 wedi'i ddatrys gan amser (PicoQuant, Berlin, yr Almaen) gyda dyfais cyfrif ffoton sengl (TCSPC) â chydberthynas amser.Defnyddir y pen deuod laser ar gyfer cyffro rhyngddalennog curiad (PIE), mae'r trawst yn mynd trwy donfedd un modd ac yn cael ei diwnio i bŵer laser o 10 i 100 nW ar gyfer llinellau laser 481 nm a 637 nm wedi'u mesur ar ôl drych deucroig.Mae hyn yn sicrhau cyfradd gyfrif ffotonau optimaidd, gan osgoi effeithiau aliasu ffoton, ffotobleaching a dirlawnder.Gosodwyd gorchuddion neu blatiau angiogenesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, yr Almaen) yn uniongyrchol mewn dŵr trochi dros lens Super Apochromat 60x NA 1.2 gyda choler gywirol (Olympus Life Sciences, Waltham, UDA).Defnyddiwyd drych deucroig 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, UDA) fel y prif holltwr trawst.Mae ymbelydredd heb ffocws yn cael ei rwystro gan dwll â diamedr o 50 micron, yna mae'r ymbelydredd ffocws yn cael ei rannu'n 2 lwybr canfod gan holltwr trawst 50/50.Defnyddiwyd hidlyddion allyriadau bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, UDA) 520/35 ar gyfer llifyn gwyrdd (AF488) a 690/70 ar gyfer llifyn coch (Atto647N) o flaen y synhwyrydd.Defnyddiwyd deuodau eirlithriadau ffoton sengl (SPAD) (Dyfeisiau Micro Ffoton, Bolzano, yr Eidal) fel synwyryddion.Perfformiwyd casglu a dadansoddi data gan ddefnyddio meddalwedd SymphoTime64 sydd ar gael yn fasnachol (PicoQuant GmbH, Berlin, yr Almaen).
Cymhwyswyd pum deg microlitr o samplau LLPS i ffynhonnau angiogenesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, yr Almaen).Mae'r delweddau canlyniadol wedi'u ffocysu i 20 µm uwchben y gwaelod ffynnon ar gyfer y pellter gweithio gwrthrychol gorau posibl ar gyfer defnynnau crog ac i ~1 µm ar gyfer rafftiau a dotiau gyda chydraniad echelinol o 0.25 µm/picsel o leiaf ac amser oedi o 400 µs/picsel.Dewiswch ddata trwy gymhwyso trothwy dwyster yn seiliedig ar ddwysedd signal cefndir cyfartalog (PBG, cymedr + 2σ) ar gyfer pob sianel fel mai dim ond defnynnau protein hylif, rafftiau, neu smotiau sy'n cael eu dewis, gan hidlo unrhyw darddiad posibl o'r cyfnod gwasgaredig.Er mwyn dadansoddi hyd oes pob rhywogaeth (τ) pob sianel (gwyrdd, “g” ar gyfer AF488 a choch, “r” ar gyfer Atto647N), dewisom ranbarthau o ddiddordeb (ROI) yn cynnwys defnynnau, rafftiau, neu smotiau (Ffigur Atodol 1). ).8b) a'u deillio trwy osod eu pydredd oes (τD, τR a τP ar gyfer defnynnau, rafftiau neu smotiau, yn y drefn honno, gweler Ffig. Atodol 8c) ym mhob sianel gan ddefnyddio dadansoddiad ffit cynffon a model dadfeiliad dwy gydran.Cyfartaledd τ o τ .Cafodd ROIs a gynhyrchodd rhy ychydig o ffotonau ar gyfer ffit aml-esbonyddol eu heithrio o'r dadansoddiad.Y toriad a ddefnyddiwyd oedd <104 o ffotonau ar gyfer rafftiau a dotiau a 103 ar gyfer diferion.Mae gan y defnynnau drothwy is oherwydd ei bod yn anodd cael cromliniau dadfeiliad â gwerthoedd dwyster uwch, gan fod y defnynnau ym maes y ddelwedd fel arfer yn llai ac yn llai niferus.Cafodd ROIs gyda chyfrif ffotonau uwchlaw'r terfyn cronni ffotonau (a osodwyd i >500 cyfrif/picsel) hefyd eu taflu i'w dadansoddi.Cydweddwch y gromlin pydredd dwyster a gafwyd o'r rhanbarth o ddiddordeb â dwyster o 90% o'r uchafswm (ychydig ar ôl dwyster uchaf y pydredd) o ddechrau bywyd y gwasanaeth i sicrhau cyn lleied â phosibl o ymyrraeth IRF tra'n cynnal yr un peth ar gyfer pob pydredd dwyster. gosodiadau Ffenestr amser cymharol Wedi'u dadansoddi 25 i 50 ROI ar gyfer rafftiau a smotiau a 15-25 ROI ar gyfer diferion, delweddau a ddewiswyd o fwy na 4 atgynhyrchiad wedi'u recordio o o leiaf 3 arbrawf annibynnol.Defnyddiwyd profion t dwy gynffon i werthuso gwahaniaethau ystadegol rhwng rhywogaethau neu rhwng systemau coacervate.Ar gyfer dadansoddiad picsel-wrth-picsel o'r oes (τ), cyfrifwyd cyfanswm gwanhad yr oes dros y cae ar gyfer pob sianel a chynhaliwyd brasamcan o fodel gwanhau esbonyddol 2/3-cydran.Yna gosodwyd y gwanhad oes ar gyfer pob picsel gan ddefnyddio gwerthoedd τ a gyfrifwyd yn flaenorol, gan arwain at ddelwedd ffit FLIM ffugliw.Roedd yr ystod oes ffit cynffon yr un fath ar draws pob delwedd o'r un sianel, ac roedd pob pydredd yn cynhyrchu digon o ffotonau i ddarparu ffit dibynadwy.Ar gyfer dadansoddiad FRET, dewiswyd picsel trwy gymhwyso trothwy dwyster is o 100 ffoton, a oedd yn gyfartaledd signal cefndir (FBG) o 11 ffoton.Cywirwyd dwyster fflworoleuedd pob sianel gan ffactorau cywiro a bennwyd yn arbrofol: 69 crosstalk sbectrol α oedd 0.004, excitation uniongyrchol β oedd 0.0305, effeithlonrwydd canfod γ oedd 0.517.Yna cyfrifir effeithlonrwydd FRET ar y lefel picsel gan ddefnyddio'r hafaliad canlynol:
lle FDD yw'r dwyster fflworoleuedd a welir yn y sianel rhoddwr (gwyrdd), FDA yw'r dwyster fflworoleuedd a welir yn y sianel derbynnydd (coch) o dan gyffro anuniongyrchol, a FAA yw'r dwyster fflworoleuedd a welir yn y sianel derbynnydd (coch) o dan gyffro uniongyrchol ( PIE).Arsylwyd corbys dwysedd fflworoleuedd yn y sianel).
Rhowch 100 µl o doddiannau adwaith LLPS sy'n cynnwys 25 µM monomerig Tau441 heb ei labelu (gyda neu heb 25 µM αS) mewn byffer LLPS (atodol fel uchod) ar ficroplatau 96-ffynnon nad ydynt yn rhwymol gyda gorchudd ffoil gludiog a ffurfiwyd defnynnau wedi'i wirio gan ficrosgopeg WF ar ôl cydbwysedd.o fewn 10 munud.Ar ôl 48 awr o ddeori ar dymheredd ystafell, cadarnhawyd presenoldeb rafftiau a smotiau protein.Yna tynnwch yr hylif yn ofalus dros y rafftiau o'r ffynhonnau, yna ychwanegwch 50 L o glustogiad daduniad (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) a deorwch am 10 munud.Mae'r crynodiad halen uchel yn sicrhau na fydd LLPS yn ailadrodd oherwydd PEG gweddilliol, a bydd cydosodiadau protein posibl a ffurfiwyd gan ryngweithiadau electrostatig yn unig yn cael eu dadosod.Yna crafu gwaelod y ffynnon yn ofalus gyda blaen micropipette a throsglwyddwyd yr hydoddiant a ddeilliodd o hynny i ffynnon arsylwi wag.Ar ôl deori'r samplau gyda 50 μM ThT am 1 h, gwiriwyd presenoldeb mannau ynysig gan ficrosgopeg WF.Paratowch ffibrilau αS sonigedig trwy ddeor 300 µl o hydoddiant 70-µM αS mewn PBS â pH 7.4, sodiwm azid 0.01% ar 37 °C a 200 rpm ar ysgydwr orbital am 7 diwrnod.Yna cafodd yr ateb ei allgyrchu ar 9600 × g am 30 munud, cafodd y belen ei hailddarlledu yn PBS pH 7.4 a'i sonigeiddio (1 munud, 50% cylch, 80% osgled mewn sonigydd Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, UDA) samplau ffibril gyda dosbarthiad maint cymharol unffurf o ffibrilau bach.
Perfformiwyd dadansoddiad FCS/FCCS a chanfod cyd-ddigwyddiad dau liw (TCCD) ar yr un microsgop confocal fflworoleuol MT200 wedi'i ddatrys gan amser (Pico-Quant, Berlin, yr Almaen) a ddefnyddiwyd ar gyfer arbrofion microsgopeg FLIM-FRET gan ddefnyddio'r modd PIE.Ychwanegwyd y pŵer laser ar gyfer yr arbrofion hyn at 6.0 µW (481 nm) a 6.2 µW (637 nm).Dewiswyd y cyfuniad o'r pwerau laser hyn i gynhyrchu disgleirdeb tebyg ar gyfer y parau o fflworofforau a ddefnyddiwyd wrth gyflawni'r cyfraddau cyfrif gorau posibl ac osgoi ffotobleaching a dirlawnder.Perfformiwyd casglu a dadansoddi data gan ddefnyddio meddalwedd fersiwn 2.3 SymphoTime64 sydd ar gael yn fasnachol (PicoQuant, Berlin, yr Almaen).
Mae samplau o agregau αS/Tau ynysig a geir gan ddefnyddio LLPS yn cael eu gwanhau mewn byffer ynysu i'r crynodiad monomoleciwlaidd priodol (gwanhad 1:500 fel arfer, gan fod agregau eisoes ar grynodiadau isel o'u hynysu o samplau coacervate).Cymhwyswyd samplau yn uniongyrchol i orchuddion (Corning, UDA) wedi'u rhag-orchuddio â hydoddiant BSA ar grynodiad o 1 mg/mL.
Ar gyfer y dadansoddiad PIE-smFRET yn y sianeli gwyrdd a choch, cymhwyswyd trothwy dwysedd is o 25 ffoton i hidlo signalau dwysedd isel a achosir gan ddigwyddiadau monomerig (sylwch fod monomerau yn fwy na samplau cyfanredol o gymharu ag agregau ynysig).Cyfrifwyd y trothwy hwn fel pum gwaith dwyster cyfartalog αS monomerig a gafwyd o ddadansoddi samplau monomer pur er mwyn dewis agregau yn benodol i'w dadansoddi.Mae'r gylched gyrru PIE, ynghyd â chaffael data TSCPC, wedi galluogi cymhwyso hidlydd pwysoliad oes sy'n helpu i ddileu croestalk cefndir a sbectrol.Cywirwyd dwyster y fflêr a ddewiswyd gan ddefnyddio'r trothwyon uchod gan ddefnyddio'r signal cefndir cyfartalog a bennwyd o'r histogramau digwyddiad yn erbyn dwyster/bin y samplau byffer yn unig.Mae pyliau sy'n gysylltiedig ag agregau mawr fel arfer yn llenwi sawl bin yn olynol yn yr olrhain amser (wedi'i osod i 1 ms).Yn yr achosion hyn, dewiswyd bin o'r cryfder mwyaf.Ar gyfer dadansoddiad FRET a stoichiometrig, defnyddiwyd y ffactor gama γ (0.517) a bennwyd yn ddamcaniaethol.Mae cyfraniadau sbectrol crosstalk a excitation uniongyrchol yn ddibwys (a bennir yn arbrofol) ar y pŵer laser excitation a ddefnyddir.Cyfrifir effeithlonrwydd a stoichiometreg FRET mewn ffrwydrad fel a ganlyn.