347 Cydran Cemegol Tiwbiau Cilio Dur Di-staen, Nodi proteinau hebryngwr antigen-A (HLA-A) newydd sy'n ymateb i interferon sy'n ymateb

Diolch am ymweld â Nature.com.Rydych chi'n defnyddio fersiwn porwr gyda chefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn ogystal, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, rydym yn dangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Sliders yn dangos tair erthygl fesul sleid.Defnyddiwch y botymau cefn a nesaf i symud trwy'r sleidiau, neu'r botymau rheolydd sleidiau ar y diwedd i symud trwy bob sleid.

Disgrifiad o'r Cynnyrch

Tiwbiau Coil Dur Di-staen 347L, Dur Gradd: SS347L

Mae'r system signalau interferon yn cymell ymateb cytocin cryf i ystod eang o signalau patholegol pathogenig a chynhenid ​​o'r amgylchedd, gan arwain at ymsefydlu is-setiau o broteinau interferon-inducible.Gwnaethom gymhwyso sbectrometreg màs traws-gyswllt wedi'i gyfryngu gan DSS (CLMS) i ganfod rhyngweithiadau protein-protein newydd ym maes proteinau a achosir gan interferon.Yn ychwanegol at y proteinau disgwyliedig interferon-inducible, gwnaethom hefyd nodi ychwanegiadau traws-gysylltiad rhyng-foleciwlaidd ac intramoleciwlaidd newydd o broteinau interferon-inducible canonaidd fel MX1, USP18, OAS3, a STAT1.Gwnaethom ganolbwyntio ar ddilysiad orthogonal set newydd o rwydweithiau protein interferon-inducible a ffurfiwyd gan broteinau HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) gan ddefnyddio cyd-immunoprecodiad a'u hastudiaeth bellach gan ddefnyddio modelu dynameg moleciwlaidd.Datgelodd modelu dynameg cydffurfiol y cymhleth protein sawl safle rhyngweithio a oedd yn adlewyrchu'r rhyngweithiadau a nodwyd yng nghanfyddiadau'r CLMS.Gyda'n gilydd, rydym yn cyflwyno astudiaeth beilot o CLMs i nodi cyfadeiladau signalau newydd a achosir gan interferon, ac yn edrych ymlaen at y defnydd ehangach o CLMs i nodi dynameg newydd o ryngweithio protein ym micro -amgylchedd y tiwmor.
Cyn i ymateb imiwnedd addasol ddechrau, mae system amddiffyn gynhenid ​​y gwesteiwr yn mowntio ymateb gwrthficrobaidd a gyfryngir gan deulu o cytocinau alffa-helical cyfrinachol o'r enw interferons (IFNs).Mae'r dosbarthiadau IFN math I IFNα ac IFNβ yn actifadu ymatebion cellog, gan gynnwys gwladwriaethau gwrthfeirysol, proapoptotig, proinflammatory, a gwrth -ymledol.Mewn bodau dynol, mae 13 isdeip o IFNα yn hysbys, pob un wedi'i glystyru ar gromosom 91. Yn rhyfeddol, dim ond IFNα2 sydd wedi'i astudio at ddefnydd clinigol.Yn ddiweddar, rhoddwyd sylw arbennig i ymchwilio ar isdeipiau eraill o IFNα.Dangosodd astudiaeth ddiweddar fod IFNα14 yn un o'r isofformau mwyaf effeithiol wrth gyfyngu dyblygu HBV2 a HIV-13,4 o'i gymharu â'r isdeip IFNα2 canonaidd.
Sefydlwyd bod cyfadeiladau derbynnydd interferon math I actifedig (IFNAR1 ac IFNAR2) yn sbarduno rhaeadr trawsgludiad signal wedi'i gyfryngu gan Janus Kinases TYK2 a JAK15,6.Mae'r Janus Janus Kinases ffosfforyleiddiad transducers signal ac ysgogwyr protein trawsgrifio (STAT1 a STAT2) ar weddillion tyrosine i gychwyn heterodimerization wedi'i gyfryngu gan barth SH26.Yn dilyn hynny, mae IRF9 yn rhwymo heterodimers stat i ffurfio cymhleth trimerig o'r genyn ffactor 3 a ysgogwyd gan IFN (ISGF3), sy'n trawsleoli i'r niwclews ac yn cymell trawsgrifio dros 2000 o enynnau a ysgogwyd gan interferon (ISGS) 5,6,7,8.
Mae ISGs yn ffurfio asgwrn cefn y system imiwnedd gynhenid, yn enwedig mewn ymateb i ymosodiad firaol.Fel llinell amddiffyn gyntaf yn erbyn haint firaol, mae celloedd yn defnyddio rhyngweithiadau helaeth proteinau cellog yn gyflym gydag ystod eang o weithgareddau biolegol.Mae'r proteinau hyn yn cynnwys derbynyddion adnabod patrwm, moleciwlau signalau, ffactorau trawsgrifio, a phroteinau â swyddogaethau gwrthfeirysol uniongyrchol, yn ogystal â rheolyddion negyddol ymatebion imiwnedd9.Daw llawer o'r wybodaeth am weithgaredd ISG o sgriniau swyddogaethol gan ddefnyddio sgriniau gor -iselder10,11 neu dechnegau distewi genynnau (siRNA, RNAi a CRISPR) 12,13 lle mae ISGs unigol yn cael eu mynegi neu eu hatal a phrofir eu gweithgaredd ar firysau amrywiol.Er bod yr astudiaethau hyn wedi pennu priodweddau gwrthfeirysol ISGs unigol, mae mecanweithiau moleciwlaidd sylfaenol pob ISG yn parhau i fod yn anhysbys i raddau helaeth.Derbynnir yn gyffredinol bod llawer o broteinau yn rhyngweithio ag un neu fwy o cytocinau i sicrhau gweithgaredd llawn, felly mae naill ai ISGs yn rhyngweithio'n uniongyrchol neu mae eu rhyngweithiadau'n cael eu cyfryngu gan broteinau cellog.Er enghraifft, nododd astudiaeth proteomeg ffotocrosslined ddiweddar ATPase VCP/p97 fel partner rhyngweithio IFITM3 mawr, y mae ei ataliad yn arwain at ddiffygion mewn didoli lysosomaidd, trosiant, a cotransport IFITM3 gyda gronynnau firaol 14.Gan ddefnyddio immunoprecodiad, gwnaethom nodi VAPA, protein sy'n gysylltiedig â fesigl, fel partner rhyngweithio ag IFITM1/2/3 sy'n cyfryngu aeddfedu firaol wedi'i gyfryngu gan golesterol, a chadarnhawyd hyn gan astudiaeth arall gan ddefnyddio system burum dau hybrid.Cefnogaeth Wyddonol 15, 16.
Proses fiolegol sylfaenol sy'n ymwneud ag atal haint a thrawsnewid malaen yw cyflwyniad antigen, sy'n cael ei gyfryngu gan foleciwlau cymhlethdod histocompatibility mawr (MHC).Mae peptidau (8-12 asid amino o hyd) o broteinau wedi'u clirio, wedi'u terfynu'n gynamserol neu wedi'u cam-blygu yn cael eu llwytho i'r heterodimer MHC-I (sy'n cynnwys cadwyni trwm ac ysgafn MHC-I, o'r enw β-2-microglobwlin; β2M) 17,18.Mae'r trimers MHC-I sefydlog sy'n deillio o hyn yn cael eu cludo i wyneb y gell, lle maent yn cyflwyno peptidau mewngellol i gelloedd CD8+ T (celloedd T cytotocsig) 17.Mae celloedd T yn cydnabod ac yn dinistrio'r pathogenau a'r celloedd hyn sy'n cario antigen tiwmor-benodol.O ganlyniad, mae pathogenau a chelloedd tiwmor yn aml yn atal y broses cyflwyno antigen er mwyn osgoi gwyliadwriaeth imiwnedd.Yn ogystal, mae MHC-I yn cael ei ddadreoleiddio mewn 40-90% o diwmorau dynol ac yn aml mae'n gysylltiedig â prognosis gwaeth19.
Rhaid i enynnau sy'n ymwneud ag ymateb i bathogenau newid yn gyflym rhwng cyflwr o orffwys a chyflwr trawsgrifio gweithredol.Felly, rhagdybir bod sawl protein cellog yn cymryd rhan yn yr ymateb i alw uchel IFN dros gyfnodau byr, gan gynnwys ailfodelu ac addasu cromatin hyrwyddwr 20,21.Mae'r rhan fwyaf o astudiaethau wedi canolbwyntio ar nodi partneriaid protein ISG unigol ym mhresenoldeb IFN.Mae sawl astudiaeth broteomig a thrawsgrifiadomig mewn systemau celloedd model wedi egluro effaith IFN ar y dirwedd gellog.Fodd bynnag, er gwaethaf dealltwriaeth gynyddol o'r ddeinameg a achoswyd gan interferons, nid ydym yn dal i wybod fawr ddim am gyfranogiad ISGs.Wrth ystyried cymhlethdod a dynameg sy'n dibynnu ar amser signalau interferon, mae dau gwestiwn yn codi: (i) a yw'n bosibl sefydlogi a thrapio'r cyfadeiladau aml-brotein sy'n gysylltiedig â signalau cyflym, a (ii) a ellir mapio'r rhyngweithiadau hyn yn ofod 3D?
Er mwyn mynd i'r afael â'r materion hyn, gwnaethom weithredu traws-gysylltu cemegol (DSS) disuccinimide is-gyfryngol ynghyd â sbectrometreg màs (CLMS) i astudio'r rhwydwaith rhyngweithio protein a ysgogwyd gan IFNα a'i ddeinameg.Mae DSS yn ychwanegu bondiau cofalent rhwng gweddillion proximal proteinau a/neu gyfadeiladau protein yn vivo.Mae dadansoddiad MS dilynol yn datgelu safleoedd croeslinio penodol sy'n adlewyrchu agosrwydd gofodol rhanbarthau o fewn protein penodol, o'r enw cysylltiadau mewnol, neu is -unedau mewn cyfadeiladau protein, o'r enw cydberthynas.Gan ddefnyddio'r dull hwn, rydym wedi nodi sawl cyfadeilad protein-protein newydd yn ogystal â rhwydweithiau rhyngweithio aml-brotein a achosir gan interferon.Trwy brofi is-set o'r rhyngweithiadau newydd hyn ymhellach, rydym yn dangos bod H2BFs (FS math histone H2B; y cyfeirir ato yma wedi hyn fel H2B) a MDN1 yn gweithredu fel partneriaid rhwymol ar gyfer HLA-A.
Celloedd FLO-1 yw un o'r modelau in vitro mwyaf adnabyddus o adenocarcinoma esophageal wrth iddynt ddynwared nodweddion allweddol tiwmorau esophageal22,23.Fodd bynnag, nid yw pob tiwmor yn imiwnogenig, ac i benderfynu a yw celloedd FLO-1 yn ymateb i driniaeth interferon, gwnaethom drin celloedd FLO-1 gyda 10 ng/ml IFNα am 72 awr.Dangosodd celloedd FLO-1 ymsefydlu cynnar o PSTAT1 ac IRF1, gan ddechrau 2 awr ar ôl triniaeth a pharhau am 72 awr, gyda gostyngiad sy'n dibynnu ar amser yn lefelau llonydd IRF1 (Ffigur 1A).Canfuwyd bod ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, ac ISG15) yn cael eu cymell yn gryf ar ôl 6 awr, gan ddynwared yr ymatebion cam clasurol canol a hwyr i IFNα (Ffigur 1A).Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn awgrymu y gellir defnyddio'r model cellog hwn i astudio ymatebion interferon.
Ymatebion mynegiant protein gwahaniaethol mewn celloedd FLO-1 ar ôl triniaeth IFNα.(A) Dadansoddwyd mynegiant protein mewn celloedd Flo-1 a gafodd eu trin â 10 ng/ml IFNα ar gyfer 2, 6, 24, 48 a 72 awr gan immunoblot gan ddefnyddio'r gwrthgyrff ISG a nodwyd.(B) Geliau SDS-Page lliw glas Coomassie o ddarnau celloedd cyfan ar ôl croesgysylltu â DSS ar gyfer amseroedd a chrynodiadau a nodwyd.(C) Immunoblot Cynrychioliadol a archwiliwyd gyda gwrthgorff p53 (DO-1) o'r un samplau i asesu graddfa'r traws-gysylltu protein.
Er mwyn dal y dirwedd rhyngweithio protein yn y fan a'r lle, gwnaethom ddefnyddio DSS, asiant traws-gysylltu a ddefnyddir yn helaeth oherwydd ei athreiddedd pilen uchel a'i amser ymateb cymharol fyr.Mae'r amser ymateb byrrach yn helpu i atal agregau mawr o broteinau croesgysylltiedig rhag ffurfio, a thrwy hynny gynnal sefydlogrwydd y croesliniwr.Er mwyn pennu'r crynodiad DSS gorau posibl ac osgoi gor-gysylltu, gwnaethom amlygu'r celloedd yn gyntaf i 5, 2.5 ac 1 mM DSS am 5, 10, 5, a 30 munud, yn y drefn honno, a dadansoddi'r lysates gan SDS-PAGE staen Coomassie Coomassie (data heb ei ddangos).Mae'n ymddangos bod lysates celloedd yn groes-gysylltiedig iawn ar y crynodiad isaf ac ar yr amser byrraf.Felly, cafodd DSS ei ditradu i 1, 0.5, a 0.1 mm dros 5 munud (Ffigur 1B).Gwelwyd y croeslinio gorau posibl gyda 0.5 mM DSS am 5 munud, a dewiswyd yr amodau hyn ar gyfer celloedd a gafodd eu trin ag IFNα.Yn ogystal, mae Ffigur 1c yn dangos blot gorllewinol a berfformiwyd gan ddefnyddio'r gwrthgorff p53 (DO-1) i asesu graddfa'r traws-gysylltu protein.
Cafodd celloedd FLO-1 eu trin â 10 ng/ml IFNα am 24 awr cyn ychwanegu'r croesgysylltydd.Yn dilyn hynny, cafodd celloedd traws-gysylltiedig eu gorchuddio gan broteolysis dau gam a phroseswyd proteinau gan FASP (Ffig. 2) 24,25.Dadansoddwyd peptidau tryptig traws-gysylltiedig yn ôl sbectrometreg màs (Ffig. 2).Yna mae'r sbectra MS/MS yn cael eu paru â'r dilyniant protein a'u meintioli â maxquant26,27.Nodwyd peptidau traws-gysylltiedig o'r sbectra a gafwyd gan ddefnyddio'r rhaglen SIM-XL, a chyfunwyd cyfansoddion unigol i mewn i rwydwaith cymhleth gan ddefnyddio piblinellau meddalwedd cyfrifiadurol ffynhonnell agored XQuest28 a SIM-XL29 (Ffig. 2).Mae SIM-XL yn nodi rhyngweithiadau protein-protein, cadwyni mewnol a chadwyni unigol mewn cymysgeddau protein syml neu gymhleth ac yn darparu sgriptiau ar gyfer delweddu rhyngweithiadau mewn strwythurau protein.Yn ogystal, mae'n graddio pob croesgyfeiriad fel sgôr ID yn ôl ansawdd sbectrwm MS/MS29.Mae sawl rhyngweithiad a chyfadeiladau protein-protein dibynadwy iawn wedi'u nodi, ac ymchwiliwyd ymhellach i set newydd o ryngweithio gan ddefnyddio cyd-immunoprecodiad a newidiadau cydffurfiol cyfadeiladau gan ddefnyddio modelu dynameg moleciwlaidd (MD) (Ffig. 2) 30, 31.
Trosolwg sgematig o'r dull CLMS.Cafodd celloedd FLO-1 eu trin â 10 ng/ml IFNα am 24 awr ac yna croesgysylltu protein yn y fan a'r lle gan ddefnyddio DSS ac yna lysis celloedd a trypsinization.Dadansoddwyd samplau traws-gysylltiedig gan ddefnyddio sbectromedr màs orbitrap a'u samplu ymhellach ar gyfer darnio rhagflaenwyr peptid yn ystod LC-MS/MS.Nodwyd dau beptid cysylltiedig o'r sbectra a gafwyd gan ddefnyddio peiriant cydnabod sbectrwm y rhaglen peptidau croesgysylltiedig (SIM-XL), a chyfunwyd yr holl gyfansoddion i mewn i rwydwaith cymhleth gan ddefnyddio piblinellau cyfrifiadol.Hidlo allan rhyngweithiadau hyder isel yn seiliedig ar sgoriau cyfradd gadarnhaol ffug (FDR).Cadarnhawyd sawl rhyngweithiad protein-protein ffyddlondeb newydd ymhellach gan ddefnyddio cyd-immunoprecodiad, ac archwiliwyd newidiadau cydffurfiol yn y cyfadeiladau gan ddefnyddio modelu dynameg moleciwlaidd (MD).
Canfuwyd cyfanswm o ~ 30,500 a ~ 28,500 o beptidau gan ddefnyddio Maxquant mewn samplau IFNα heb eu cymell a'u hysgogi, yn y drefn honno (Tabl Atodol S1, Ffig. 3 A).Dangosodd y dosbarthiad hyd peptid yn y ddau achos gyfran uwch o beptidau mwy, gan nodi presenoldeb peptidau traws-gysylltiedig (Ffig. 3 B, C).Yn ogystal, roedd cyfran fwy o beptidau mwy yn bresennol yn yr ystod 40-55 mewn samplau wedi'u trin â IFNα (Ffig. 3 C).Dangosodd mapio protein yn erbyn dwyster log2 mai proteinau clasurol a ysgogwyd gan interferon oedd y mwyaf niferus o gymharu â samplau heb eu trin, gan gynnwys MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, a HLA-F (Ffigur 3D).Dangosodd dadansoddiad o lwybrau ar gyfer proteinau mwy na thriphlyg a gyfoethogwyd mewn ymateb i driniaeth IFNα gan ddefnyddio cronfa ddata llwybr Reactome mai cyflwyniad a phrosesu antigen wedi'i gyfryngu gan MHC-I oedd y llwybr amlycaf (Ffigur 3E).Yn gyson ag adroddiadau cynharach, roedd ymatebion gwrthfeirysol a gyfryngwyd gan OAS ac ISG15 yn ogystal ag IFNα/β a signalau cytocin ymhlith y llwybrau a actifadwyd.Yn ogystal, nodwyd croesgysylltiadau protein sy'n benodol i lysin a serine o'r sbectra MS/MS a gafwyd yn wreiddiol gan ddefnyddio SIM-XL.Adroddodd astudiaeth ddiweddar fod 104 o ISGs yn rhychwantu 20 firws o 9 dosbarth firws trwy feta-ddadansoddiad o astudiaethau gor-iselder ISG unigol mewn 5 math o gell9.Fodd bynnag, er mwyn goresgyn cyfyngiadau cyfrifiadol sgrinio setiau data mawr, gwnaethom ddechrau gyda set ddata lai i archwilio rhyngweithio posibl rhwng y rhestr o enynnau IRDS a adroddwyd gan Padaria et al., Y mae'r mwyafrif ohonynt yn ISGs.
Nodi proteinau traws-gysylltiedig a fynegir yn wahanol mewn ymateb i IFNα (data a gafwyd gan Maxquant).(A) Diagram Venn sy'n cynrychioli nifer y peptidau cyffredin ac unigryw a nodwyd mewn samplau FLO-1 wedi'u trin a heb eu trin IFNα14.Dosbarthiad hyd peptid samplau croesgysylltiedig wedi'u trin (B) ac IFNα wedi'u trin (C).(D) Map gwres sy'n cynrychioli log2 (dwyster LFQ) rhwng celloedd FLO-1 heb eu trin ac IFNα14.Mae'r panel chwith yn dangos y proteinau sy'n cael eu actifadu'n fwyaf gweithredol ym mhresenoldeb IFNα.(E) Histogram sy'n cynrychioli'r 20 prif lwybr cyfoethogi ar ôl triniaeth IFNα.Dadansoddodd cronfa ddata llwybr Reactome fwy na newidiadau pedair gwaith mewn proteinau sy'n ymateb i IFNα wedi'u rheoleiddio.
Mae ysgogiad ISG wedi'i gyfryngu gan interferon wedi'i gofnodi'n dda, ond ar y lefel foleciwlaidd deallir yn wael sut mae'r proteinau hyn yn arwain at ystod eang o swyddogaethau biolegol.Gwnaethom ymchwilio i ryngweithio protein gyda lefel uchel o hyder rhwng ISGs hysbys.Yn ddiddorol, gwnaethom nodi rhwydwaith gan gynnwys proteinau MX1, USP18, ROBO1, OAS3, a STAT1 sy'n ffurfio cymhleth mawr mewn ymateb i driniaeth IFNα (Ffigur 4, Tabl S2) 32,33,34.Yn bwysicaf oll, darganfuwyd y rhyngweithiadau hyn ym mhob triphlyg a gafodd eu trin ag IFNα ac ni chawsant eu canfod mewn samplau heb eu trin, gan awgrymu eu bod wedi'u ffurfio'n benodol mewn ymateb i driniaeth IFNα.Mae'n hysbys bod STAT1 yn rheoleiddio mynegiant yr ISGs hyn, ond nid yw ei ryngweithio ag ISGs ar y lefel protein wedi'i astudio.Dangosodd strwythur grisial STAT1 nad yw ei barth helical (CCD) yn ymwneud â'r rhyngweithio â DNA neu brotomers wrth ffurfio dimers35.Mae'r α-helices hyn yn ffurfio strwythur helics helical sy'n darparu arwynebedd hydroffilig yn bennaf i ryngweithio ddigwydd 35.Yn ein data CLMS, gwelsom fod y rhan fwyaf o'r rhyngweithio â STAT1 wedi digwydd yn y parth SH2 cyn y CCD, y parth cysylltydd, neu'r gynffon C-terminal (gweddillion 700-708) (Ffigur 4A).Adroddodd astudiaeth flaenorol fod USP18 yn rhwymo i barth CCD a rhwymo DNA (DBD) STAT2 ac yn cael ei recriwtio i is-uned y derbynnydd interferon Math I IFNAR2 i gyfryngu ataliad signalau interferon math I 24.Dangosodd ein data hefyd fod parth catalytig USP18 yn rhyngweithio â STAT1 DBD (Ffigur 4A, D), gan awgrymu y gallai STAT1 a STAT2 chwarae rôl wrth ddenu USP18 i IFNAR2.
Rhwydwaith ISG protein-protein a nodwyd mewn celloedd traws-gysylltiedig sy'n cael eu trin ag IFNα.(A) Llain rhyngweithio 2D yn dangos rhyngweithiadau protein-protein (a gynhyrchir yn y rhaglen SIM-XL), gyda llinellau'n cynrychioli rhyngweithiadau rhyngfoleciwlaidd (toriad croesgysylltiad wedi'i osod i 3.5).Mae parthau gwahanol hunaniaethau yn cael eu nodi gan eu parth lliw32: mx1, dynamin_n (73–249), dynamin_m (259–547), a GED (569-660).Parthoedd OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_TRANSF_2 (780-872), ac OAS1_C (903-108).Domain Robo1, IG_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), IG_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3, fn3 (678–758) a FN3 (777–864).Meysydd STAT1: STAT_INT (2–120), STAT_ALPHA (143–309), STAT_BIND (321–458), SH2 (573-657), a STAT1_TAZ2BIND (715–739).(B) Gwyliwr crwn o broteinau traws-gysylltiedig (MX1, UBP18, OAS3, Robo1, a STAT1) gyda rhyngweithiadau a rhyngweithiadau wedi'u labelu mewn glas a choch, yn y drefn honno.Gosodwyd y trothwy traws-gyswllt yn 3.5.Mae plotiau dot yn nodi safleoedd rhyngweithio STAT1 â MX1 (C), USP18 (d), Robo1 (E), ac OAS3 (F), yn ogystal â safleoedd rhyngweithio K neu S rhwng y ddau beptid.Yn y ffigur, mae'r trothwy sgôr traws-gyswllt wedi'i osod i 3.0.(E) amryw o safleoedd rhyngweithio rhwng parthau DI STAT1 ac OAS3 wedi'u harosod ar eu strwythurau protein mewn pymol (system graffeg moleciwlaidd PYMOL, fersiwn 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (ID PDB: 1BF533) ac OAS3 (ID PDB: 4S3N34).) Rhaglen.
Mae dau isofform o USP18 wedi cael eu disgrifio mewn bodau dynol, protein hyd llawn sydd wedi'i leoli'n bennaf yn y niwclews, ac isofform heb barth N-derfynell, USP18-SF, sydd wedi'i ddosbarthu'n gyfartal yn y cytoplasm a niwclews 36.Yn ogystal, rhagwelwyd y byddai'r N-derfynfa yn anstrwythuredig ac nid oes angen gweithgaredd isopeptidase na rhwymo ISG1537 arno.Roedd y rhan fwyaf o'r rhyngweithiadau a nodwyd yn ein hastudiaeth wedi'u lleoli yn N-derfynfa'r protein, gan awgrymu bod y rhyngweithiadau hyn yn cynnwys USP18 hyd llawn (Ffigur 4A, D) ac felly'n debygol o ddigwydd yn y niwclews.At hynny, mae ein data hefyd yn dangos bod y N-derfynfa yn arbenigo ar gyfer rhyngweithiadau protein-i-brotein.Mae'r safle rhwymo IFNAR2 wedi'i leoli rhwng gweddillion 312-368, ac yn nodedig, nid oes yr un o'r proteinau yn y cymhleth yn rhwymo i'r rhanbarth hwn (Ffig. 4 A) 37,38.Mae'r data hyn gyda'i gilydd yn dangos bod y parth rhwymo IFNAR2 yn cael ei ddefnyddio'n unig gan y protein derbynnydd.Yn ogystal, dim ond OAS3 a Robo1 y canfuwyd eu bod yn gysylltiedig â pharthau i fyny'r afon o'r safle rhwymo N-terminus ac IFNAR2 (Ffigur 4A).
Mae Robo1 yn perthyn i superfamily imiwnoglobwlin (Ig) moleciwlau signalau traws -bilen ac mae'n cynnwys pum parth Ig a thri pharth ffibronectin (FN) yn y rhanbarth allgellog.Dilynir y parthau allgellog hyn gan ranbarth pilen-proximal a helix traws-bilen sengl 39. Mae rhanbarth mewngellol anstrwythuredig wedi'i leoli yn y C-derfynfa ac mae'n cynnwys motiffau dilyniant gwarchodedig sy'n cyfryngu protein effeithydd effaith 239.Mae'r rhanbarth sy'n ymestyn o asidau amino ~ 1100 i 1600 yn anhwylder yn bennaf.Canfuom fod MX1 yn rhyngweithio â Robo1 trwy barthau Ig, FN, a mewngellol, tra bod y rhan fwyaf o ryngweithio â STAT1 yn digwydd rhwng ei CCD, parth cysylltydd, a C-derfynfa Robo1 (Ffig. 4a, E).Ar y llaw arall, dosbarthwyd rhyngweithiadau â rhanbarthau cysylltydd DI, DIII, ac OAS3 ledled y protein Robo1 (Ffig. 4 A).
Mae'r teulu protein oligoadenylate synthase (OAS) yn derbyn ac yn rhwymo RNA haen ddwbl mewngellol (dsRNA), yn cael newidiadau cydffurfiol, ac yn syntheseiddio oligoadenylates 2 ′, 5'-gysylltiedig (2-5 fel) 40.Canfuwyd, ymhlith y tri OASs, bod OAS3 yn arddangos y affinedd uchaf ar gyfer dsRNA ac yn syntheseiddio'r swm lleiaf o 2-5 fel, a all actifadu RNase L a thrwy hynny gyfyngu ar ddyblygu firaol 41.Mae'r teulu OAS yn cynnwys parthau transferase niwcleotid beta polymeras (pol-β).Mae ymchwil flaenorol wedi dangos bod gweithgaredd catalytig y parth C-terminal (DIII) yn dibynnu ar y parth rhwymo dsRNA (DI), sy'n ofynnol ar gyfer actifadu OAS342.Gwnaethom arsylwi bod parthau DI a DII OAS3 yn rhyngweithio â CCD a rhanbarth cyffordd bach rhwng Sh2 a Stat1 TAD (Ffigur 4A, F).Datgelodd troshaenu gwahanol safleoedd croeslinio ar y strwythur protein ryngweithio rhwng y ddalen β-ddalen a dolen DBD STAT1 a phoced agored neu geudod a ffurfiwyd gan weddillion 60-75 ym mharth di OAS3 (Ffig. 4G).Roedd cyfeiriadedd y proteinau yn y cyfadeilad hefyd yn dangos nad oedd yr un o'r rhyngweithio ag OAS3 yn ymyrryd â gallu rhwymo DNA ei barth DI (Ffig. S1A).Yn ogystal, mae parth N-derfynell GTPase MX1 yn rhyngweithio'n helaeth â pharthau DI a DIII OAS3 (Ffig. 4 A).Gwnaethom hefyd arsylwi rhyngweithio rhwng OAS1 a MX1 ym mhob un o'r tri ailadroddiad a gafodd eu trin â IFNα, lle bu parth OAS1 sengl (hefyd yn weithredol yn gatalytig) yn rhyngweithio â'r tri pharth MX1 (Ffigur S2A, B).
Mae proteinau MX yn rhan o deulu mawr o GTPases tebyg i Dynein sy'n cynnwys parth GTPase N-derfynell sy'n clymu ac yn hydrolyzes GTP, parth canolradd sy'n cyfryngu hunan-ymgynnull, a zipper leucine C-terminal sy'n gweithredu fel GTPase (LZ ).Effaith Parth Domain25,43.Mae MX1 yn rhwymo i is -unedau polymeras firaol i rwystro trawsgrifio'r genyn firaol43.Dangosodd sgrin dau-hybrid burum a adroddwyd yn flaenorol fod MX1 sy'n gysylltiedig â PIAs1 yn atal actifadu genynnau wedi'i gyfryngu gan STAT1 trwy rwystro gweithgaredd rhwymo DNA a bod ganddo hefyd weithgaredd ligase SUMO E344,45.Yma, rydym yn dangos bod MX1 yn rhwymo i STAT1 (Ffigur 4C, D), fodd bynnag, mae angen astudio ymhellach sut mae'r rhyngweithio hwn yn effeithio ar actifadu genynnau wedi'i gyfryngu gan STAT1 mewn ymateb i IFNα.Yn ogystal, gwelsom hefyd fod MX1 yn rhyngweithio ag IFIT3 a DDX60 ym mhob un o'r tri ailadroddiad a gafodd eu trin â IFNα (Ffig. S2C).
Mae DDX60 yn helicase cytoplasmig a achosir gan IFN yr adroddwyd o'r blaen ei fod yn chwarae rôl wrth ddiraddio rig-I-annibynnol o RNA46 firaol.Mae'n rhyngweithio â RIG-I ac yn actifadu ei signalau mewn dull ligand-benodol 46. Mae DDX60 yn cynnwys parth helicase DEXD/H-blwch a pharth helicase C-terminal sy'n rhwymo RNA firaol a DNA47.Mae'r rhan fwyaf o'i ryngweithio â MX1 ac IFIT3 yn digwydd o fewn rhanbarthau hir N- a C-terminal heb barthau na motiffau canonaidd (Ffig. S2E, F).Fodd bynnag, mae MX1 hefyd yn gysylltiedig â pharth helicase DEXD/H-blwch (Ffig. S2E).Mae gan broteinau'r teulu IFIT gopïau tandem o fotiff helix-troi-helix nodedig o'r enw'r ailadrodd tetrapeptid (TPR).Canfuwyd bod IFIT3 yn fodulator positif o signalau RIG-I ac felly'n gydran o gyfadeilad MAVS.Gyda'i gilydd, mae ein data yn awgrymu bod IFIT3 a DDX60 yn rhyngweithio'n bennaf yn y rhanbarth rhwng TPR 3–6 o IFIT3 ac y gallant chwarae rôl mewn signalau RIG-I/MAVS (Ffig. S2F).
O ystyried bod sgrinio’r proteome cyfan yn ddwys yn gyfrifiadurol, yna gwnaethom sgrinio cronfa ddata gyfan Uniprot dynol i gyd ar gyfer presenoldeb un o’r ailadroddiadau a gafodd eu trin â IFNα.Yn y replica hwn, gwelsom sawl rhwydwaith rhyngweithio dibynadwy iawn ar gyfer HLA-A.Dangosodd dadansoddiad o lwybrau protein a nodwyd gan sbectra MS/MS mai prosesu a chyflwyno antigen wedi'i seilio ar MHC yw'r prif lwybr a achosir gan interferon (Ffig. 3D).Felly, gwnaethom ganolbwyntio ar astudio rhyngweithiadau protein moleciwlau MHC-I gyda lefel uchel o hyder ym mhob sampl traws-gysylltiedig.Mae HLA yn cynnwys parthau α1, α2 a α3 a chadwyni ysgafn, ac mae microglobwlin β2 (β2M) yn brotein hebryngwr cyson49.Ar ôl ymgynnull yn y reticulum endoplasmig, mae HLA yn ansefydlog yn absenoldeb ligandau peptid50.Mae'r rhigol sy'n rhwymo peptid yn cael ei ffurfio gan y parthau α1 ac α2 hynod polymorffig a heb strwythur ar ffurf nad ydynt yn peptid a'r parth cymharol llai polymorffig α351.Ym mhresenoldeb IFNα, gwnaethom ganfod dau gyfadeilad HLA-A: mae un yn rhyngweithio â HMGA1 a H2B (Ffigur 5, Tabl S3) ac mae'r llall yn rhyngweithio â MDN1, LRCH4 a H2B (Ffigur 6).
Mae IFNα yn cymell rhwydwaith rhyngweithio HLA-A â H2B (H2BFS) a HMGA1.(A) Plot 2D (a gynhyrchir mewn meddalwedd SIM-XL) yn darlunio gwahanol fathau o ryngweithio yn y cymhleth H2B-HLA-A-HMGA1: InterLink (glas), interlink (coch) a dolen sengl (du)..Mae parthau gwahanol hunaniaethau wedi'u codio â lliw32: H2B (histone; 2–102) a MHC-I (MHC_1; 25–203, grŵp C1; 210–290 a MHC_I_C; 337–364).Gosodwyd y trothwy traws-gyswllt yn 3.5.Mae plotiau dot yn dynodi safleoedd rhyngweithio HLA-A â H2B (B) a HMGA1 (C), yn ogystal â safleoedd rhyngweithio K neu S rhwng y ddau beptid.Yn y ffigur, mae'r trothwy sgôr traws-gyswllt wedi'i osod i 3.0.(D) Perthynas rhwng proteinau a ddangosir yn strwythurau proteinau H2B, HLA-A, a HMGA1 yn y rhaglen PYMOL.Modelwyd y strwythurau hyn gan ddefnyddio'r gweinydd Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) a'r strwythurau templed ar gyfer y proteinau H2B, HLA-A a HMGA1 oedd 1kx552, 1kj349 a 2eze55, yn y drefn honno.
Mae IFNα yn cymell rhwydwaith rhyngweithio HLA-A gyda H2B (H2BFS), MDN1 a LRCH4.(A) Crosslinks intramoleciwlaidd (coch) a rhyngfoleciwlaidd (glas) a gyflwynir ar fap rhyngweithiol 2D (a gynhyrchir mewn meddalwedd SIM-XL) gyda MDN1 yn cael ei gynrychioli fel cylch.Gosodwyd y trothwy traws-gyswllt yn 3.5.Mae parthau o wahanol hunaniaethau wedi'u codio â lliw32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grŵp C1; 210–290 a MHC_I_C; 337–364) a LRCH4 (LRR_8 (68–126),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,. LRR_8 (137–194) a CH (535–641)).(B) Perthynas rhwng proteinau a ddangosir yn strwythurau proteinau H2B, HLA-A, LRCH4, a MDN1 yn y rhaglen PYMOL.Modelwyd y strwythurau hyn gan ddefnyddio'r gweinydd Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) gyda strwythurau templed 1kx552, 1kj349, 6hlu62 a 6i2665 ar gyfer y proteinau h2b, hla-a, lrch4 a md, lrch4 a md, lrch4 a md, lrch4 a md, LRCH4 a mDCH4 a mD, LRCH4 A, LRCH4 A, LRCH4 A, LRCH4 A, LRCH4 A, LRCH4 A, LRCH4 A, LRCH4 A MDLECH4 a MDAL yn y drefn honno.Lleiniau dot yn dangos safleoedd rhyngweithio K neu S ar gyfer HLA-A gyda H2B (C), LRCH4 (D), a MDN1 (E).Ar gyfer lleiniau, gosodwyd y trothwy sgôr traws-gyswllt i 3.0.
Yn ogystal â chynnal cyfanrwydd y genom, mae histone H2B hefyd yn ymwneud â rheoleiddio trawsgrifio.Mae'r protein H2B yn cynnwys parth histone canolog (HFD) a ffurfiwyd gan dri α-helices wedi'u gwahanu gan ddolenni a chynffon C-derfynell 41,52.Mae'r rhan fwyaf o'r rhyngweithio â H2B yn digwydd yn yr helics α1, sy'n darparu trimerization gyda'r heterodimer HFD (Ffig. 5 A, B).Er bod lysinau yn ymwneud â rhwymo DNA, mae rhai lysinau hefyd yn safleoedd asetyliad neu fethylation amgen.Er enghraifft, nid yw gweddillion K43, K46, a K57 o H2B yn ymwneud â rhwymo DNA uniongyrchol, ond maent yn dargedau o amrywiol addasiadau ôl-drawsgrifiadol53.Yn yr un modd, gall gweddillion K44, K47, a K57 yn H2B chwarae rhan amgen ym mhresenoldeb IFNα, gan gynnwys rhyngweithio â phroteinau eraill (Ffig. 5a, b).Yn ogystal, mae'r histone allthromosomal H2B yn actifadu'r ymateb imiwnedd mewn gwahanol fathau o gelloedd, gan weithredu fel synhwyrydd cytosolig i ganfod darnau DNA (dsDNA) â haen ddwbl sy'n deillio o asiantau heintus neu gelloedd sydd wedi'u difrodi54.Ym mhresenoldeb firysau DNA, roedd disbyddu H2B yn atal cynhyrchu IFN-β a ffosfforyleiddiad STAT154.Gwyddys bod H2B hefyd yn symud i mewn ac allan o'r niwclews yn gyflymach na histonau craidd eraill54.Gwelwyd rhyngweithiadau H2B â MDN1 a LRCH4 hefyd mewn samplau dethol heb eu trin.Canfuom fod HLA-A yn rhyngweithio â H2B ym mhob un o'r tri sampl a gafodd eu trin â IFNα ac mewn un sampl ailadrodd heb ei drin.Mae'r data hyn yn adlewyrchu rôl H2B mewn swyddogaeth ffisiolegol amgen sy'n annibynnol ar reoleiddio trawsgrifio.
Mae HMGA1 (grŵp symudedd uchel yn-fach 1), niwcleoprotein bach sy'n llawn asidau amino sy'n hybu afiechydon, wedi'i nodi mewn cysylltiad â HLA-A.Mae ganddo gynffon C-terminal asidig a thri DBD gwahanol o'r enw bachau oherwydd eu bod yn rhwymo i rigol fach y rhanbarth cyfoethog yn DSDNA55,56.Mae'r rhwymiad hwn yn achosi i'r DNA blygu neu sythu, gan ganiatáu i ffactorau trawsgrifio canonaidd gael mynediad at ei ddilyniant consensws.Credir bod y gynffon C-terminal yn ymwneud â rhyngweithiadau protein-protein a recriwtio ffactorau trawsgrifio, gan nad yw mwtaniaid dileu C-terminal yn gallu cychwyn trawsgrifio57.At hynny, mae'r parth hwn yn cynnwys sawl safle ffosfforyleiddiad gwarchodedig sy'n swbstradau hysbys ar gyfer cinases 58.Gwnaethom arsylwi rhyngweithiadau HLA-A a H2B â HMGA1 y tu allan i'r parth C-terminal, gan awgrymu bod y parth C-terminal yn cael ei ddefnyddio'n bennaf ar gyfer rhwymo ffactor trawsgrifio (Ffig. 5a, c).Mae proteinau HMGA yn cystadlu â histone H1 i'w rhwymo i DNA addasydd, a thrwy hynny gynyddu hygyrchedd57.Yn yr un modd, mae'n ymddangos yn debygol bod HMGA yn rhyngweithio â histone H2B ar hyd y DNA cysylltydd mewn cystadleuaeth â histone H1.Mae HMGB1 yn cymell mynegiant HLA -A, -B, a -C mewn celloedd dendritig, gan arwain at eu actifadu59, ond ni adroddwyd yn flaenorol am ryngweithio rhwng HMG a HLA.Canfuom fod HMGA1 yn rhyngweithio â pharthau α1 ac α3 HLA-A, gyda'r rhan fwyaf o'r rhyngweithiadau y tu allan i'w 3 dBD (Ffigur 5A, C).Yn ein dwylo, canfuwyd bod HLA-A wedi'i leoleiddio yn y niwclews (data heb ei ddangos), ac o ystyried bod H2B a HMGA1 hefyd yn bresennol yn y niwclews, mae'r rhyngweithio hwn yn debygol o ddigwydd yn y niwclews.Dangosir ychwanegiadau penodol a fesurir rhwng H2B, HLA-A, a HMGA1 yn Ffigur 5D.
Mae'r rhan fwyaf o ryngweithiadau HLA-A â phroteinau eraill yn digwydd o fewn ei barthau α1 ac α2 a'r parth C-terminal anhwylder (Ffig. 6).Yn un o'r enghreifftiau hyn, gwelsom fod HLA-A yn rhyngweithio â chynffon N-derfynell anhwylder LRCH4 (Ffigur 6A, D).Mae LRCH4 yn rheoleiddio actifadu TLR4 ac ymsefydlu cytocin LPS, a thrwy hynny fodiwleiddio'r ymateb imiwnedd cynhenid60,61.Mae'n brotein pilen gyda naw ailadroddiad llawn leucine (LRRs) a motiff homoleg calmodulin (ch) yn ei ectodomain, ac yna parth traws-bilen (TMD) 60, 62.Adroddwyd bod parthau CH yn cyfryngu rhyngweithiadau protein-protein 60.Mae darn o tua 300 o asidau amino rhwng y parthau LRR a CH yn gymharol hygyrch ond yn anhrefnus.Yn seiliedig ar swyddogaeth rhanbarthau anhrefnus fel cyfryngwyr rhwydweithiau protein-protein a chludiant pothellog 63, gwelsom fod y rhan fwyaf o ryngweithio protein yn digwydd mewn rhanbarthau anhwylder.Dosbarthwyd rhyngweithiadau â MDN1 trwy gydol y protein, gan gynnwys y LRR1, LRR6, parthau CH, a rhanbarthau ar hap, tra bod H2B yn rhwym yn bennaf i'r parth CH (Ffig. 6a, b).Yn nodedig, nid oedd yr un o'r rhyngweithiadau yn cynnwys y TMJ, gan awgrymu penodoldeb y dull CLMS (Ffigur 6A, B).
Mae MDN1 hefyd wedi'i nodi fel rhan o'r rhwydwaith protein HLA-A (Ffigur 6A).Mae'n perthyn i'r teulu AAA o broteinau (ATPases sy'n gysylltiedig â gwahanol weithgareddau).Dyma'r un parth AAA N-derfynell sy'n trefnu i mewn i gylch hecsamerig ac yn tynnu ffactor y cynulliad o'r is-uned ribosomaidd 60au 64.yn ymddangos yn debyg i Dynein64,65,66.Yn ogystal, dilynir rhanbarth ASP/Glu Rich gan barth MIDAS (safle dibynnol ïon metel).Oherwydd maint mawr MDN1 (tua 5600 o asidau amino) a'i homoleg gyfyngedig gyda phroteinau sydd wedi'u hastudio'n dda, ychydig a wyddys am ei strwythur a'i swyddogaeth mewn bodau dynol.Gwnaethom nodi HLA-A, H2B, a LRCH4 fel partneriaid rhwymo MDN1 a datgelu eu cyfeiriadedd fel cyfadeiladau protein mewn pymol (Ffig. 6a, b).Mae'r tri phrotein hyn yn rhyngweithio â pharth AAA, y parth cysylltydd tebyg i Dynein, ac o bosibl parth MIDAS MDN1.Mewn adroddiad blaenorol, nododd puro affinedd proteinau abwyd MDN1 fel protein sy'n gysylltiedig â histone H2B67.Yn ogystal, nododd astudiaeth ddiweddar hefyd ryngweithio rhwng MDN a HLA-B mewn celloedd HCT116 gan ddefnyddio sbectrometreg màs wedi'i buro â chysylltiad, gan gefnogi ein canfyddiadau68.Mae nodi'r cymhleth hwn mewn samplau wedi'u trin â IFNα yn awgrymu rôl ar gyfer MDN1 mewn signalau interferon.
Oherwydd bod genynnau HLA yn polymorffig iawn, gwnaethom dynnu dilyniant yn darllen mapio HLA -A, -B, a -C o ddata dilyniannu RNA o gelloedd FLO -1 (ni ddangosir data).Datgelodd dilyniannau peptid sy'n gyson â'r darlleniad dilyniannu wahaniaethau sylweddol rhwng HLA-A, -B, a -C mewn rhanbarthau lle roedd peptidau traws-gysylltiedig wedi'u lleoli yn HLA-A (Ffigur S3).Yn ogystal, ni wnaethom arsylwi croesgysylltu protein-i-brotein o foleciwlau HLA-B/C â phroteinau H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Mae hyn yn awgrymu bod y rhyngweithio protein a geir rhwng HLA-A, MDN1, LRCH1 a HMGA1 yn HLA-A penodol.Yn ogystal, dangosodd dadansoddiad proteinomig o samplau nad ydynt yn groesgysylltiedig (Tabl S4) fod gan HLA-A sylw dilyniant uwch o'i gymharu â HLA-B neu HLA-C.Roedd y peptidau a nodwyd ar gyfer HLA-A yn uchel o ran dwyster mewn samplau a gafodd eu trin â IFNα a heb eu trin.
Er mwyn sicrhau nad oedd y rhyngweithiadau a nodwyd yma oherwydd croesgysylltu dau brotein yn amhenodol yn agos at agosrwydd gofodol, gwnaethom gadarnhau dau ffactor rhyngweithiol HLA-A newydd trwy berfformio profion cyd-immunoprecodiad.Canfuwyd rhyngweithiadau HLA-A â MDN1 mewndarddol a H2B mewn celloedd FLO-1 wedi'u trin â IFNα a heb eu trin (Ffigur 7, Ffigur S4).Gwnaethom gadarnhau bod HLA-A wedi ei gipio gan H2B yn yr immunoprecipitates a bod y gymdeithas hon oherwydd triniaeth IFNα gan fod HLA-A yn absennol yn y samplau immunoprecipitate o gelloedd heb eu trin (Ffigur 7A).Fodd bynnag, mae ein data yn awgrymu bod IFNα yn rheoleiddio rhwymo HLA-A yn wahanol i H2B a MDN1.Mae IFNα yn cymell cysylltiad rhwng H2B a HLA-A, ond yn lleihau ei gysylltiad â MDN1.Canfuom fod MDN1 yn gysylltiedig â HLA-A mewn rheolyddion, a bod ychwanegu IFNα yn lleihau'r rhyngweithio hwn yn annibynnol ar ymsefydlu MDN1 gan IFNα (Ffigur 7B, C).Yn ogystal, cipiodd immunoprecodiad HLA-A H2B mewn celloedd A549 (Ffig. S4), gan awgrymu bod y rhyngweithio hwn yn annibynnol ar y math o gell.Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn cefnogi rhyngweithiadau HLA-A wedi'u cyfryngu gan interferon â H2B a MDN1.
Mae HLA-A yn cyd-buro H2B a MDN1.Roedd imiwnoblots H2B (A) a MDN1 (B) cynrychioliadol yn cael eu himiwnio o gelloedd FLO-1 wedi'u trin â IFNα a'u profi ar gyfer y gwrthgyrff a nodwyd.Defnyddiwyd IgG llygoden a chwningen fel rheolaeth negyddol.(C) Mae symiau cymharol (mewnbwn) o wahanol antigenau yn cael eu darlunio gan imiwnoblotiau a brofwyd yn erbyn gwrthgyrff a nodwyd, defnyddiwyd β-actin fel rheolaeth llwytho.
Ymchwiliwyd i briodweddau strwythurol un o'r rhwydweithiau traws-gysylltiedig hynod ddibynadwy a achosir gan interferon, H2B-HLA-A-HMGA1.Gwnaethom ddefnyddio modelu dynameg moleciwlaidd fel dull amgen i ddeall dynameg cydffurfiol y proteinau sy'n gysylltiedig â'r cymhleth hwn (Ffigur 8).Mae casgliadau o'r data CLMS yn awgrymu posibilrwydd gwahanol gydymffurfiadau o broteinau H2B, HLA-A, a HMGA1.Felly, modelwyd y cyfadeiladau posibl canlynol mewn cyfrwng toddyddion: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, a H2B-HLA-A-HMGA1.Awgrymodd sgrin docio protein-protein cychwynnol gan ddefnyddio'r pecyn MOE (amgylchedd gweithredu moleciwlaidd; Pecyn Cyfrifiadura Cemegol Inc., Montreal, Quebec, Canada) gydymffurfiadau posibl sy'n wahanol rhwng y proteinau hyn (Ffig. 8a).Datgelodd delweddu'r cymhleth protein docio sawl rhyngweithio a chydymffurfiad posibl (Ffigur 5a, 8).Felly, dangosir un cydffurfiad posibl yn Ffigur 8A (gyda chroesgysylltiadau wedi'u labelu) a chafodd ei werthuso ymhellach gan ddefnyddio'r biblinell fodelu MD.Yn ogystal, mae rhwymo H2B neu HMGA1 i HLA-A yn tynnu sylw at affinedd uwch H2B ar gyfer HLA-A (Ffig. 8a).
Dynameg cydffurfiol rhwydweithiau posibl rhwng cyfadeiladau H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A, a H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Mae'r panel chwith yn fap 2D (a gynhyrchir mewn meddalwedd SIM-XL) o groesgysylltiadau intramoleciwlaidd (coch) a rhyng-foleciwlaidd (glas) (toriad croeslink wedi'i osod i 3.5).Yn ogystal, mae gweddillion traws-gysylltu a nodwyd wedi'u labelu ar strwythurau proteinau H2B, HLA-A, a HMGA1.Tynnwyd cydymffurfiadau cysylltiedig y proteinau hyn gan ddefnyddio'r biblinell docio a weithredwyd yn y pecyn MOE.Mae'r panel chwith isaf yn dangos gwahanol gydymffurfiadau posibl cyfadeiladau H2B-HLA-A a HMGA1-HLA-A gyda chysylltiadau rhwymo protein-protein (GBVI/WSA DG; KCAL/MOL).(B) Gwyriad safonol (RMSD) o safleoedd atomig (ac eithrio atomau hydrogen) ar gyfer pob strwythur protein.(C) Rhyngweithiadau bond hydrogen protein rhyngfoleciwlaidd-protein o amrywiol gyfadeiladau efelychiedig o ystyried rhyngweithiadau penodol hyd ≥ 10 ns.Gosodwyd y pellter torri rhoddwr-derbynydd H-bond i 3.5 Å, a gosodwyd yr ongl torri rhoddwr-H-dderbynydd i ≥ 160 ° –180 °.(D) Gweddillion wedi'u labelu sy'n ffurfio rhyngweithiadau protein-protein HLA-A â'u partneriaid priodol, yn rhychwantu ≥ 20 ns, wedi'u tynnu o gyfadeiladau ffug HLA-A-H2B a HLA-A-HMGA1.Mae strwythurau protein yn cynrychioli strwythur cyfartalog o 100 ns MDS.(E) Rhyngweithiadau rhwng cyfadeiladau HLA-A-H2B a HLA-A-HMGA1 o gymharu â rhyngweithiadau a draciwyd gan efelychiad H2B-HLA dros 100 ns yn seiliedig ar y safle rhyngweithio K neu S rhwng y ddau beptid.Cymhlethdodau /HMGA1-HLA-A /H2B-HLA-A-HMGA1.Gosodwyd y gwerth trothwy ar gyfer gwerthuso croesgysylltiadau i 3.0, ac ystyriwyd rhyngweithiadau penodol o MDs sy'n cymryd ≥ 10 ns.Delweddwyd strwythurau protein gan ddefnyddio Biovia Discovery Studio (Dassault Systèmes, Biovia Corp., San Diego, CA, UDA) ac amgylchedd gweithredu moleciwlaidd (Moe; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) pecynnau.
Nododd sefydlogrwydd moleciwlau HLA-A dros amser (gwyriad safonol; RMSD neu wyriad safonol; RMSF) fod presenoldeb proteinau H2B neu HMGA1 yn y cyfadeiladau yn sefydlog HLA-A (Ffigur 8B, Ffigur S5).Mae'r protein HMGA1 yn clymu'n dynn â safle B2M HLA-A, gan ysgogi sefydlogrwydd yr asidau amino HLA-A yn y cymhleth HLA-A-HMGA1 neu H2B-HLA-A-HMGA1 (Ffigur 8b, Ffigur S5).Yn benodol, canfuwyd bod gweddillion HLA ~ 60-90 a ~ 180-210 yn llai hyblyg ym mhresenoldeb H2B (Ffig. 8b).Dangosodd H2B a HMGA1 well rhwymo i HLA-A yn y cymhleth H2B-HLA-A-HMGA1 o'i gymharu â rhwymiad HLA-A i H2B neu HMGA1 yn unig (Ffigur 8c, D; Tabl S5).Mae gweddillion sy'n ymwneud â bondio hydrogen (deiliadaeth uchel wedi'i fodelu MD ≥ 10 ns) yn cyd -fynd â safleoedd rhyngweithio CLMS (gweddillion K neu S) yn y cymhleth, gan awgrymu bod y rhyngweithiadau a nodwyd gan CLMs yn ddibynadwy iawn.Dibynadwyedd (Ffig. 8E).Mewn modelu CLMS a MD, canfuwyd bod gweddillion HLA-A rhwng tua 190-210 a thua 200-220 o asidau amino yn rhwymo H2B a HMGA1, yn y drefn honno (Ffig. 8E).
Mae rhyngweithiadau protein-protein yn ffurfio rhwydweithiau strwythurol deinamig sy'n cyfryngu cyfathrebu mewngellol mewn ymateb i rai ysgogiadau.Oherwydd bod llawer o ddulliau proteinomeg yn canfod newidiadau yn lefel cyflwr cyson cyffredinol protein, mae dynameg rhyngweithio protein-protein yn gofyn am offer ychwanegol i ddal rhyngwynebau rhwymol, ac mae CLMs yn un offeryn o'r fath.Mae'r system signalau interferon yn rhwydwaith cytocin sy'n caniatáu i gelloedd ymateb i ystod o signalau pathogenig a chynhenid ​​amgylcheddol, gan arwain at ymsefydlu is-setiau o broteinau interferon-inducible.Gwnaethom gymhwyso CLMs i benderfynu a ellid nodi rhyngweithiadau protein-protein newydd ymhlith panel o broteinau a achosir gan interferon.Defnyddiwyd dadansoddiad traws-gysylltu protein byd-eang mewn model Cell FLO-1 sy'n ymateb i interferon i ddal cyfadeiladau protein.Mae echdynnu peptidau tryptig o gelloedd nad ydynt yn gysylltiedig â chysylltiad a chroes-gysylltiedig yn caniatáu ar gyfer cyfrif peptid, cyfoethogi llwybr, a dosbarthiad hyd peptid gyda dwyster LFQ diffiniedig.Nodwyd proteinau canonaidd-interferon-inducible fel rheolaeth fewnol gadarnhaol, tra gwelwyd ychwanegiadau traws-foleciwlaidd ac intramoleciwlaidd newydd o broteinau interferon canonaidd-inducible fel MX1, UP18, OAS3 a STAT1.Ymchwiliwyd i nodweddion a rhyngweithio strwythurol amrywiol mewn meysydd swyddogaethol.
Canfuwyd rhyngweithio rhwng HLA-A, MDN1 a H2B trwy imiwnoblotio mewn celloedd FLO-1 ac A549 a gafodd eu trin a'u trin ag IFNα.Mae ein canlyniadau'n tynnu sylw bod HLA-A yn cyfadeiladu â H2B mewn modd sy'n ddibynnol ar IFNα.Mae ein gwaith yn cynrychioli llwybr diddorol ar gyfer archwilio ymhellach gydleoli'r ddau gyfadeilad hyn.Byddai hefyd yn ddiddorol ehangu'r dull CLMS at banel o linellau celloedd i nodi rhyngweithiadau protein wedi'i gyfryngu gan interferon sy'n annibynnol ar gell.Yn olaf, gwnaethom ddefnyddio modelu MD fel dull amgen i ddeall dynameg cydffurfiol proteinau sy'n gysylltiedig â chymhleth H2BFS-HLA-A-HMGA1, a oedd yn olrhain traws-siaradau intramoleciwlaidd a rhyng-foleciwlaidd.Mae casgliadau o'r data CLMS yn awgrymu posibilrwydd gwahanol gydymffurfiadau o'r proteinau H2BFS, HLA-A, a HMGA1.Datgelodd y gwahanol gydymffurfiadau posibl rhwng y cyfadeiladau protein docio hyn sawl rhyngweithiad tebyg i'r rhai a arsylwyd yn set ddata CLMS.Un o brif gryfderau ein dull yw ei fod yn caniatáu adnabod genynnau polymorffig iawn fel HLA yn hawdd, felly bydd yn ddiddorol astudio rhyngweithiadau proteinau HLA haploteip-benodol sydd fel arall yn anodd eu hastudio.Gyda'i gilydd, mae ein data yn dangos y gellir defnyddio CLMs i ehangu ein dealltwriaeth o rwydweithiau signalau a achosir gan interferon a darparu sylfaen ar gyfer astudio systemau rhynggellog mwy cymhleth ym micro-amgylchedd y tiwmor.
Cafwyd celloedd FLO-1 gan ATCC a'u cynnal mewn DMEM (GIBCO) wedi'u hategu ag 1% penisilin/streptomycin (Invitrogen), serwm buchol y ffetws 10% (GIBCO) a'u storio ar 37 ° C a 5% CO2.Deori.Tyfwyd celloedd i gydlifiad 70-80% cyn cael eu trin ag IFNα14 (a weithgynhyrchwyd gan Gyfleuster Cynhyrchu Protein Caeredin).Prynwyd yr holl gemegau ac adweithyddion eraill gan Sigma Aldrich oni nodir yn wahanol.
Tyfwyd celloedd FLO-1 mewn platiau 6-ffynnon a drannoeth cafodd y celloedd eu trin â 10 ng/ml IFNα14 am 24 awr i gydlifiad oddeutu 80%.Golchwyd celloedd dair gwaith gyda PBS a'u clymu â DSS wedi'i baratoi'n ffres (Thermo Fisher Scientific) (wedi'i doddi yn DMSO) yn PBS am 5 munud ar 37 ° C. i grynodiad terfynol o 0.5 mm.Disodlwyd yr adwaith croeslinio DSS â PBS a diffoddwyd DSS gweddilliol trwy ychwanegu Tris 20 mm (pH 8.0) yn PBS am 15 munud ar 37 ° C.Casglwyd celloedd trwy grafu a'u casglu mewn tiwbiau rhwymo isel (axygen).
Cafodd y belen gell ei gorchuddio â 300 µl o byffer lysis wrea (8 m wrea, tris 0.1 m, pH 8.5) am 30 munud ar dymheredd yr ystafell gydag ysgwyd achlysurol.Perfformiwyd yr holl gamau centrifugio ar 14,000 xg ar 8 ° C.Centrifuge y lysate am 10 munud a throsglwyddo'r uwchnatur i diwb newydd.Diddymwyd y gronynnau clir sy'n weddill mewn 150 μl o'r ail byffer lysis (2 m wrea, 2% (w/v) SDS (sylffad sodiwm dodecyl)) am 30 munud neu fwy nes y cafwyd toddiant dyfrllyd homogenaidd.Cafodd y lysate ei centrifugio am 20 munud ac roedd yr uwchnatur yn gymysg â'r lysate a gafwyd yn y cam blaenorol.Aseswyd crynodiadau protein gan ddefnyddio'r assay micro BCA (Thermo Fisher Scientific) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr ar gyfer gweithdrefnau microplate.Cafodd y samplau eu rhewi'n gyflym mewn nitrogen hylifol a'u storio ar -80 ° C.
Proseswyd oddeutu 100 μg o brotein traws-gysylltiedig hydawdd gan ddefnyddio protocol paratoi sampl hidlo wedi'i addasu (FASP) fel y disgrifiwyd gan Wisniewski et al.69 Yn fyr, mae'r protein wedi'i groesgysylltu â 200 µl o byffer wrea (8 m wrea mewn tris 0.1 m, pH 8.5), wedi'i fortecsio a'i haneru.Perfformiwyd yr holl gamau centrifugio ar 14,000 xg ar 25 ° C.Trosglwyddwyd hanner cyntaf y lysate protein traws-gysylltiedig i ddyfais hidlo allgyrchol microcon 10 kDa gyda philen ultracel-10 (Merck), ac yna centrifugation ar yr hidlydd am 25 munud.Yna ychwanegwch ail hanner y protein i'r hidlydd ac ailadroddwch yr un camau.Perfformiwyd adferiad protein trwy ychwanegu 100 μl o hydroclorid ffosffin (TCEP) Tris 17 mm Tris (2-carboxyethyl) mewn byffer wrea.Cafodd adferiad ei droi ar thermomixer ar 600 rpm am 30 munud ar 37 ° C.Yn ogystal, cafodd y golofn ei centrifugio a alkylated y protein traws-gysylltiedig is gan ddefnyddio 100 μl o iodoacetamid 50 mM mewn byffer wrea.Gwnaed yr adwaith alkylation ar dymheredd yr ystafell am 20 munud yn y tywyllwch.Cylchdroi'r golofn, golchwch waliau'r golofn 3 gwaith gyda byffer wrea 100 µl, ac yna centrifuge.Perfformiwyd yr un gweithrediad 3 gwaith gan ddefnyddio 100 μl o 100 mM amoniwm bicarbonad.Cyn trypsinization, disodli'r tiwb casglu gydag un newydd.Ychwanegwch byffer treulio sy'n cynnwys bicarbonad amoniwm 50 mM a trypsin 1 µl wedi'i wanhau mewn byffer trypsin (Promega).Cynhaliwyd cymhareb y trypsin i brotein tua 1:33, a deorwyd adweithiau treuliad dros nos ar 37 ° C. mewn siambr laith.Cafodd y peptid croesgysylltiedig ei echdynnu o'r hidlydd trwy centrifugation am 25 munud.Gwellwyd adferiad peptid trwy ychwanegu 50 μl o 0.5 M NaCl i'r hidlydd, ac yna centrifugio am 25 munud.
Defnyddiwyd colofnau troelli micro C18 (cyfarpar Harvard) i ddiswyddo peptidau tryptig traws-gysylltiedig yn dilyn y protocol a ddisgrifiwyd gan Bouchal et al.70 gyda mân addasiadau.Yn fyr, actifadwyd colofnau troelli C18 gyda thair golchiad o 0.1% asid fformig (FA) mewn acetonitrile (ACN) (Merck) a dwy olchfa o 0.1% FA.Cafodd y golofn ei hydradu gyda 0.1% FA am 15 munud.Llwythwch samplau i mewn i golofnau troelli a'u golchi 3 gwaith gyda 0.1% FA.Cafodd y peptidau wedi'u dihalwyno eu hechdynnu'n olynol gyda graddiant cam wrth gam gan ddefnyddio 50%, 80% a 100% ACN mewn 0.1% FA.Cafodd y samplau eu sychu mewn crynodydd SpeedVac ynghyd â (Eppendorf) nes i'r hylif gweddilliol ddiflannu'n llwyr.Diddymwyd y peptidau eluted mewn 100 μl o asid trifluoroacetig 0.08% mewn 2.5% ACN a mesurwyd y crynodiadau ar Nanodrop 2000 (Thermo Scientific).Chwistrellwyd oddeutu 1 μg o peptid croesgysylltiedig fesul sampl i'r system LC-MS/MS.
Cafodd peptidau traws-gysylltiedig eu gwahanu ar system 3000 rslcnano LC yn y pen draw (Thermo Scientific) wedi'i gysylltu â sbectromedr màs orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Casglwyd peptidau traws-gysylltiedig ar golofn ddal C18 300 µm, 5 mm o hyd µ---colofn C18 wedi'i bacio â sorbent sorbent C18 PEPMAP100 a sorbent PEPMAP 5 µM (Thermo Scientific).Llwythwch y llif pwmp wedi'i osod ar 5 µl/min 0.08% asid trifluoroacetig wedi'i hydoddi mewn 2.5% ACN.Cafodd peptidau traws-gysylltiedig eu gwahanu ar golofn silica wedi'i asio dadansoddol gyda diamedr mewnol o 75 μm a hyd o 150 mm, wedi'i lenwi â sorbent pepmap 2 μm (Thermo Scientific).Roedd cyfnodau symudol A a B yn cynnwys 0.1% FA mewn dŵr a 0.1% FA mewn acetonitrile, yn y drefn honno.Mae'r graddiant yn dechrau ar 2.5% B ac yn cynyddu'n llinol i 40% B dros 90 munud, yna i 90% B dros y 2 funud nesaf.Cynhaliwyd cyfansoddiad y cyfnod symudol ar 90% B am 10 munud ac yna gostwng yn llinol i 2.5% B dros 2 funud.Cafodd y golofn ei chydbwyso ar 2.5% B am 8 munud cyn y cylch nesaf.Cafodd peptidau traws-gysylltiedig eu hychwanegu o'r golofn ddadansoddol eu ïoneiddio mewn ffynhonnell ionization nanoelectrospray (NSI) a'u chwistrellu i mewn i sbectromedr màs Exploris 480 (Thermo Scientific).
Roedd sbectromedr màs Orbitrap Exploris 480 yn gweithredu yn y modd cydberthynas data cadarnhaol.Perfformiwyd sgan llawn yn y modd adran ar ddatrysiad o 120,000 gyda gosodiadau amrediad o m/z 350 a -i m/z 2000 fed.Gosodwyd y targed AGC wedi'i normaleiddio ar 300% gydag uchafswm amser mewnbwn o 50ms.Mae canfod brig monoisotopig wedi'i sefydlu ar gyfer peptidau.Mae'r paramedr ymlacio cyfyngiadau wedi'i osod i wir os canfyddir rhy ychydig o ragflaenwyr.Gosodwyd isafswm cryfder ïonig y rhagflaenydd i 5.0E3 a chynhwyswyd gwladwriaethau gwefr rhagflaenydd hyd at +8 yn yr arbrofion.
Gosodwyd yr amser beicio rhwng sganiau mawr yn y modd cydberthynas data i 2.5 eiliad.Gosodwyd gwaharddiad màs deinamig i 20 s ar ôl darnio cyntaf yr ïon rhagflaenol.Gosodwyd y ffenestr ynysu rhagflaenol i 2 fed.Dewiswyd y math o egni gwrthdrawiad wedi'i normaleiddio â modd ynni gwrthdrawiad sefydlog mewn sgan MS/MS sy'n ddibynnol ar ddata.Ynni gwrthdrawiad wedi'i osod i 30%.Gosodwyd y penderfyniad orbitrap i 15,000 a tharged yr AGC i 100%.Mae'r amser pigiad uchaf pwrpasol wedi'i osod i 60 milieiliad.
Cyn olrhain y rhwydwaith protein-protein mewn samplau traws-gysylltiedig, gwnaethom brosesu'r ffeiliau amrwd gan ddefnyddio'r pecyn maxquant (fersiwn 1.6.12.0) 26,27 i nodi peptidau/proteinau y gellir eu holrhain yn y samplau.Yn ogystal, perfformiwyd dadansoddiadau proteinomig tebyg ar samplau FLO-1 heb eu cysylltu a gafodd eu trin a'u trin ag IFNα.Chwiliwyd data MS/MS yn y gronfa ddata ddynol uniprot (www.uniprot.org) (a uwchlwythwyd Awst 12, 2020, yn cynnwys 75,093 o gofnodion) gan ddefnyddio'r peiriant chwilio adeiledig Andromeda27.Cynhaliwyd y chwiliad heb nodi penodoldeb yr ensym ac amrywiol addasiadau i emideiddio (n, q) ac ocsidiad (m).Gosodwyd goddefiannau màs rhagflaenol ar 20 ppm ac ïonau cynnyrch ar 0.02 Da.Gosodwyd y gwyriad màs cychwynnol ac uchaf i 10 ppm.Gosodwyd màs uchaf y peptid ar 4600 DA a gosodwyd tebygrwydd y dilyniant rhwng 7 a 25 asid amino (AA).Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol pellach gan ddefnyddio'r rhaglen Perseus (fersiwn 1.6.10.45).Cyfrifwyd cynnwys protein trwy normaleiddio dwyster sbectrol y protein (dwyster LFQ; meintioli heb ei labelu) 27 a throswyd y gwerthoedd dwyster i log2.Adeiladwyd clystyru hierarchaidd o broteinau a nodwyd gan eu dwyster peptid gan ddefnyddio'r pecyn PHEATMAP (v1.0.12) yn R (V 4.1.2).Perfformiwyd dadansoddiad cyfoethogi llwybr gan ddefnyddio cronfa ddata llwybr Reactome ar gyfer proteinau wedi'u trin â IFNα a oedd fwy na phedair gwaith wedi'u actifadu o gymharu â samplau heb eu trin.
Perfformiwyd adnabod lysin (k) neu serine (au) croesgysylltiadau cemegol penodol o gyfadeiladau protein a fonitrwyd gan LC-MS/MS gan ddefnyddio peiriant adnabod sbectrosgopig (SIM-XL) ar gyfer peptidau traws-gysylltiedig (SIM-XL) 29.Yn gyntaf, ymchwiliwyd i ryngweithio posibl rhwng genynnau llofnod gwrthiant difrod DNA sy'n gysylltiedig â interferon (IFN) (IRDS) gan ddefnyddio set ddata protein IRDS a ddisgrifir yn Padariya et al.28.Mae sgrinio pob amod ac ailadroddiadau o'r uniprot dynol cyfan yn ddwys yn gyfrifiadurol, felly mae'r gronfa ddata UNIProt ddynol gyfan (www.uniprot.org) (wedi'i lawrlwytho 12 Awst 2020, yn cynnwys 75,093 o gofnodion) yn erbyn ailadroddiadau wedi'u trin â IFNα.Un o'r hidlwyr ar gyfer rhyngweithio ymddiriedaeth uchel.Ehangwyd a phrofwyd y rhyngweithiadau arwyddocâd uchel hyn a gafwyd ym mhob ailadrodd ac amod.
Yn SIM-XL, defnyddiwyd DSS ar gyfer y Crosslinker (XL) a gosodwyd y newid pwysau XL a newid pwysau addasu i 138.06 a 156.07, yn y drefn honno.Ystyrir y safleoedd adweithio croeslinio canlynol: KK, KS a KN-TERM, heb ïonau gohebydd.Gosodwyd rhagflaenydd a darn ppm i 20 a gosodwyd trothwy XREA i 0.15.Ystyriwyd bod trypsin yn hollol benodol, a gweithredwyd dull darnio C-C-trap (HCD) uchel.Gosodwyd trothwy gostyngiad DB deinamig XCorr a'r nifer lleiaf o beptidau ar gyfer gostyngiad deinamig DB i 2.5 a 2, yn y drefn honno.Paramedrau eraill yw: tebygolrwydd monoisotop a thoriad cyd -ddigwyddiad brig, lleiafswm o 4 gweddillion AA fesul llinyn a'r gwefr llinyn uchaf, a 3 uchafsymiau o holltiadau a gollwyd.Dadansoddwyd y mapiau 2D wedi'u pwytho o ganlyniad yn (SIM-XL) a defnyddiwyd cynrychiolaeth graffigol XQuest28 i adeiladu'r mapiau 2D.Darperir croesgysylltiadau protein ar strwythurau protein yn PYMOL (system graffeg moleciwlaidd PYMOL, fersiwn 2.0 Schrödinger, LLC).
Crëwyd strwythurau model protein gan ddefnyddio gweinydd Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 gan ddefnyddio egwyddorion modelu homoleg a gweithredu'r “dull cudd Markov”.Mae Phyre2 yn cynhyrchu strwythurau model yn seiliedig ar aliniad dilyniant â strwythurau protein hysbys.Ar gyfer proteinau H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, a MDN1, defnyddiwyd strwythurau templed 1KX552, 1KJ349, 2EZE55, 6HLU62, a 6I2665.Yn ogystal, ystyriwyd strwythur Alphafold71 MX1, UBP18 a Robo1 hefyd.Delweddwyd y strwythur protein gan ddefnyddio pecyn Visualizer Stiwdio Discovery Biovia (Dassault Systèmes, Biovia, San Diego, CA, UDA) a'r pecyn amgylchedd gweithredu moleciwlaidd (MOE; cemegol Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).