ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tiwb Weldiedig Deublyg Ar gyfer cydran gemegol y Diwydiant Cemegol, Mae diffyg SPECC1L yn arwain at sefydlogrwydd cynyddol o gymalau sbleis a llai o golli celloedd crib niwral cranial.

Diolch am ymweld â Nature.com.Rydych chi'n defnyddio fersiwn porwr gyda chefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn ogystal, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, rydym yn dangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tiwb Weldiedig Duplex Ar gyfer Diwydiant Cemegol

Liaocheng Sihe SS materol Co., Ltd.yn wneuthurwr blaenllaw sy'n arbenigo mewn pibellau di-dor dur di-staen, tiwbiau anelio llachar, tiwbiau torchog di-dor ac ati.Er mwyn hwyluso cwsmeriaid, rydym wedi weldio pibellau a thiwbiau hefyd.Liaocheng Sihe SS materol Co., Ltd.sydd â'r offer cynhyrchu a phrofi mwyaf datblygedig.Gallwn fodloni eich gofynion yn llwyr.Yn ôl y safon yn llym iawn, mae tiwbiau a gynhyrchir gennym bob amser â goddefgarwch OD a WT cywir.Mae'r rheolaeth goddefgarwch yn gwbl unol â safonau cynhyrchu.Mae ein cynnyrch bob amser yn fodlon â chwsmeriaid.Mae cwsmeriaid yn prynu ein cynnyrch yn creu mwy o elw.
a) OD (Diamedr Allanol): 3.18mm i 101.6mm
b) WT (Trwch Wal ): 0.5mm i 20mm
c) Hyd: Yn unol â gofynion y cwsmer
d) Safonau : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ac ati
e) Dull Proses: ERW, EFW ac ati

Sliders yn dangos tair erthygl fesul sleid.Defnyddiwch y botymau cefn a nesaf i symud trwy'r sleidiau, neu'r botymau rheolydd sleidiau ar y diwedd i symud trwy bob sleid.
Mae'r celloedd crib niwral cranial (CNCC) yn llithro oddi ar y plygiadau niwral embryonig ac yn mudo i'r bwâu pharyngeal, sy'n ffurfio'r rhan fwyaf o'r strwythurau wyneb canol.Mae camweithrediad CNCC yn chwarae rhan bwysig yn etioleg hollt y geg, camffurfiad cynhenid ​​cyffredin.Mae mwtaniadau heterosygaidd SPECC1L wedi'u canfod mewn cleifion â holltau annodweddiadol a syndromig.Yma, rydym yn adrodd am staenio gwell ar gydrannau cyffordd gludiog canonaidd (AJ), β-catenin ac E-cadherin mewn celloedd dymchwel SPECC1L diwylliedig, ac mae micrograffau electron yn dangos trylediad apigol-basal o AJ.Er mwyn deall rôl SPECC1L mewn morffogenesis creuanwynebol, rydym wedi creu model llygoden diffygiol Specc1l.Mae mutants homosygaidd yn embryonig angheuol ac yn arddangos nam ar gau tiwb niwral a lamineiddiad CNCC.Cynyddir staenio protein AJ mewn plygiadau niwral mutant.Mae'r diffyg AJ hwn yn gyson â diffyg delamination CNCC, sy'n gofyn am ddiddymu AJ.Yn ogystal, mae mutants Specc11 wedi lleihau signalau PI3K-AKT a chynyddu apoptosis.In vitro, roedd ataliad ysgafn o signalau PI3K-AKT mewn celloedd math gwyllt yn ddigon i achosi newidiadau AJ.Yn bwysig, gellir gwrthdroi newidiadau AJ a achosir gan ddymchwel SPECC1L trwy weithredu'r llwybr PI3K-AKT.Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn awgrymu bod angen SPECC1L, fel rheolydd newydd ar gyfer signalau PI3K-AKT a bioleg AJ, ar gyfer cau tiwb niwral a haeniad CNCC.
Mae celloedd crib niwral cranial (CNCCs) yn lleoleiddio i'r niwroectoderm dorsal ac yn ymwahanu oddi wrth niwroepitheliwm y plygiadau niwral sy'n datblygu trwy broses sy'n cynnwys y trawsnewid epithelial-mesenchymal (EMT)1,2,3.Mae CNCCs epithelial premigrating yn tarfu ar gyffyrdd rhynggellog ac yn dod yn CNCCs mesenchymal mudol sy'n llenwi'r bwâu pharyngeal cyntaf ac ail ac yn ffurfio'r rhan fwyaf o'r cartilag creuanwynebol.Felly, mae genynnau sy'n rheoleiddio swyddogaeth CNCC yn aml yn cael eu tarfu yn etioleg anomaleddau cynhenid ​​​​creanio-wynebol megis holltau'r wyneb, sy'n effeithio'n fwyaf cyffredin ar 1/800 o enedigaethau yn yr UD yn unig.Un o'r anffurfiadau cynhenid8.
Mae delamineiddio'r CNCC yn cyd-daro â chau'r tiwb niwral blaenorol rhwng 8.5 a 9.5 diwrnod o ddatblygiad embryonig mewn llygod.Mae mwtaniaid nifer o enynnau sy'n gysylltiedig â holltau neu'r wyneb llygoden hefyd yn arddangos rhyw fath o ddiffyg tiwb niwral, gan gynnwys Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, a Pdgfrα12.Fodd bynnag, gellir ystyried prosesau cau tiwb niwral a haeniad CNCC yn annibynnol, gan fod y llygoden mutant Splotch (Pax3) yn arddangos diffygion wrth gau tiwb niwral heb unrhyw effaith ar haeniad CNCC na mudo 13,14.Bydd modelau llygoden ychwanegol gyda diffygion mewn dyraniad CNCC a chau tiwb niwral yn helpu i amlinellu sail foleciwlaidd gyffredin y ddwy broses hyn.
Mae ynysu CNCC o gelloedd niwroepithelial yn gofyn am ddiddymu cyffyrdd gludiog (AJs), sy'n cynnwys cyfadeiladau protein sy'n cynnwys, ymhlith eraill, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, a α-actinin sy'n gysylltiedig â ffilamentau actin 2 ■ Astudiaethau gorfynegiant Dangosodd e-cadherin mewn plygiadau niwral leihad neu oedi mewn dadlaminiad CNCC.I'r gwrthwyneb, mae atal E-cadherin yn arwain at haenu cynnar15,16.Mae llawer o'r ffactorau sy'n cyfryngu EMT yn ystod haeniad CNCC yn ffactorau trawsgrifio (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) a phroteinau ailfodelu matrics allgellog (ECM) fel matrics metalloproteinases (MMPs), ond mae CNCCs yn rheolyddion AJ cytosgerbydol uniongyrchol. ddim yn hysbys eto.Gwyddys bod llwybr PI3K-AKT yn gwrthdaro â lefelau E-cadherin, yn bennaf o ymchwil canser17.Mae astudiaethau diweddar wedi dangos bod colli signalau PI3K-AKT seiliedig ar PDGFα mewn llygod yn arwain at annormaleddau creuanwynebol, gan gynnwys taflod hollt a namau ar y tiwb niwral12.Fodd bynnag, mae'r berthynas rhwng y llwybr PI3K-AKT a sefydlogrwydd AJ ar haeniad CNCC yn aneglur.
Yn flaenorol, gwnaethom nodi SPECC1L fel y genyn mutant cyntaf mewn dau berson â hollt difrifol sy'n ymestyn o'r geg i'r llygad, a elwir yn hollt arosgo (ObFC) neu hollt Tessier IV18.Mae treigladau SPECC1L wedi'u nodi mewn dau deulu aml-genhedlaeth â'r syndrom awtosomaidd Opitz G/BBB dominyddol (OMIM #145410), lle'r oedd unigolion yr effeithiwyd arnynt yn arddangos gor-bellter a gwefus/taflod hollt19, ac mewn un teulu â syndrom gor-bellter Tibi (OMIM #145420)20 .mae mwy na hanner yr achosion o syndrom Opitz G/BBB yn gysylltiedig â X (OMIM #300000) ac yn cael eu hachosi gan fwtaniadau yn y genyn MID1, sy'n amgodio protein 22 o sgerbwd celloedd sy'n gysylltiedig â microtiwb.Rydym yn damcaniaethu y gallai SPECC1L, sydd hefyd yn brotein sy'n gysylltiedig â microtiwbwles a'r cytoskeleton actin, gyfryngu'r signalau sydd eu hangen ar gyfer ailfodelu cytoskeleton actin yn ystod adlyniad celloedd a mudo 18 .Trwy astudiaethau in vitro ac in vivo, rydym bellach yn disgrifio SPECC1L fel rheolydd newydd o sefydlogrwydd AJ trwy signalau PI3K-AKT.Ar y lefel gellog, arweiniodd diffyg SPECC1L at ostyngiad yn lefel y protein pan-AKT a chynnydd yn y gwasgariad apigol-sylfaenol o AJ, a gafodd ei ddileu gan actifadu cemegol y llwybr AKT.Yn fyw, mae embryonau diffygiol Specc11 yn dangos nam ar gau tiwb niwral a llai o ddyraniad CNCC.Felly, mae SPECC1L yn gweithredu mewn signalau sy'n seiliedig ar adlyniad celloedd wedi'u rheoleiddio'n iawn sy'n ofynnol ar gyfer swyddogaeth CNCC arferol yn ystod morffogenesis wyneb.
Er mwyn nodweddu rôl SPECC1L ar y lefel gellog, defnyddiwyd y llinell gell osteosarcoma sefydlog U2OS a ddisgrifiwyd yn flaenorol yn ddiffygiol yn SPECC1L18.Roedd gan y celloedd U2OS sefydlog hyn gyda chwalfa SPECC1L (kd) ostyngiad cymedrol (60-70%) yn lefelau trawsgrifiadau a phroteinau SPECC1L, ynghyd â diffygion mewn mudo ac ad-drefnu'r cytoskeleton actin 18. Mewn cyferbyniad, cafwyd gostyngiad dros dro difrifol mewn Dangoswyd bod SPECC1L yn arwain at ddiffygion mitotig 23 .Ar ôl nodweddu ymhellach, canfuom fod ein celloedd SPECC1L-kd sefydlog wedi newid morffoleg ar lefel cydlifiad uchel iawn (Ffigur 1).Roedd celloedd rheoli unigol a chelloedd kd ar gydlifiad isel yn edrych yn debyg (Ffigur 1A,D).24 awr ar ôl ymasiad, celloedd rheoli cadw eu siâp ciwboidol (Ffig. 1 B, E), tra bod celloedd SPECC1L-kd hirgul (Ffig. 1 C, F).Cafodd maint y newid hwn mewn siâp celloedd ei ddal gan ddelweddau byw in vivo o gelloedd rheoli a chelloedd kd (ffilm 1).Er mwyn pennu rôl SPECC1L mewn celloedd cydlifiad, fe wnaethom archwilio ei fynegiant yn gyntaf.Canfuom fod lefelau protein SPECC1L wedi cynyddu ar ymasiad (Ffigur 1G), tra nad oedd lefelau trawsgrifio SPECC1L yn cynyddu (Ffigur 1H).Yn ogystal, wrth i ddwysedd celloedd gynyddu, cronnodd protein SPECC1L ar ffiniau rhynggellog (Ffig. 2A-E), gyda phatrwm sy'n gorgyffwrdd â phatrwm β-catenin sy'n gysylltiedig â philen (Ffig. 2A'-E ').O ystyried y cysylltiad rhwng SPECC1L a'r actin cytoskeleton 18,23, rhagdybiwyd gennym fod SPECC1L yn rhyngweithio â chyffyrdd gludiog sy'n seiliedig ar actin (AJ).
(AF) Mae celloedd dymchwel SPECC1L (DF) yn ymestyn ar gydlifiad uchel (F) o gymharu â chelloedd rheoli U2OS (AC).Dyma dri o'r chwe phwynt amser (T1, T3, T6) a ddewiswyd gennym ar gyfer gwahanol ddwysedd celloedd.(G) Dadansoddiad blot gorllewinol yn dangos bod y protein SPECC1L wedi'i sefydlogi ar lefel uchel o gydlifiad o'i gymharu â lefel isel o gydlifiad mewn celloedd rheoli.Mae blot gorllewinol SPECC1L yn dangos y band 120 kDa disgwyliedig a band pwysau moleciwlaidd uwch, o bosibl wedi'i addasu'n ôl-gyfieithu (*).Perfformiwyd dadansoddiad blotiau gorllewinol o dan yr un amodau ar gyfer cydlifiad isel ac uchel.Cymerwyd delweddau yn dangos SPECC1L ar gydlifiad isel ac uchel o'r un blot.Cafodd yr un blot ei dynnu a'i ail-archwilio â gwrthgorff β-actin.(H) Ni ddangosodd dadansoddiad meintiol RT-PCR unrhyw newidiadau sylweddol yn lefelau trawsgrifiadau SPECC1L.Mae bariau gwall yn cynrychioli SEMs o bedwar arbrawf annibynnol.
(AE) Dewisom chwe phwynt amser (T1-T6) yn cynrychioli ystod o ddwysedd celloedd i normaleiddio dadansoddiad siâp celloedd a newidiadau AJ mewn celloedd U2OS gyda dymchweliad SPECC1L (kd).Roedd y pum pwynt amser cyntaf yn cynnwys celloedd sengl (T1), ymasiad 50-70% o glystyrau celloedd bach (T2), ymasiad heb ail-lunio celloedd kd (T3), ail-lunio celloedd kd (T4), a newidiadau 24 awr.ar ffurf posterior celloedd kd (T5).Mae'r protein SPECC1L ei wasgaru yn bennaf yn y cytoplasm yn T1 (A), ond mae ei groniad Gwelwyd ar ffiniau rhynggellog ar adegau dilynol amser (B-E, saethau).(FJ) β-catenin yn dangos cronni tebyg ar ffiniau rhynggellog sy'n gysylltiedig â'r cymhleth AJ.(A'-E') Mae SPECC1L a β-catenin yn dangos staenio gorgyffwrdd ar ffiniau celloedd ar ddwysedd celloedd uchel (saethau).(F'-J') Mewn celloedd SPECC1L-kd, mae staenio β-catenin yn ymddangos yn normal ar ddwysedd celloedd isel (F'-H '), ond yn ehangu wrth i siâp celloedd newid (I', J'; saethau), gan nodi bod AJ wedi newid.Bariau = 10 µm.
Yna fe wnaethom geisio pennu effaith diffyg SPECC1L ar AJ.Fe wnaethom ddefnyddio sawl marciwr sy'n gysylltiedig ag AJ, gan gynnwys y cydrannau canonaidd F-actin, myosin IIb, β-catenin, ac E-cadherin24,25,26,27.Cynyddodd ffibrau straen actin mewn celloedd SPECC1L-kd fel y disgrifiwyd yn flaenorol (Ffig. 3A, B) 18 .Dangosodd Myosin IIb sy'n gysylltiedig â ffilamentau actin gynnydd tebyg mewn celloedd SPECC1L-kd in vitro (Ffig. 3C, D).Mae β-catenin sy'n gysylltiedig ag AJ yn rhwymo i cadherin yn y gellbilen, gan ddangos patrwm mynegiant “diliau” arferol mewn ciwbocytau rheoli (Ffig. 3E, G).Yn ddiddorol, mewn delweddau gwastad gan ddefnyddio microsgopeg confocal, dangosodd staenio β-catenin (Ffig. 3E,F) ac E-cadherin (Ffig. 3G,H) ar gellbilen celloedd diffygiol SPECC1L batrymau amlwg o staenio estynedig.Roedd yr ehangiad hwn o staenio β-catenin sy'n gysylltiedig ag AJ mewn celloedd kd yn fwyaf amlwg yn y cydlifiad, ond roedd yn ymddangos ei fod yn rhagflaenu newidiadau mewn siâp celloedd (Ffig. 2F-J, F'-J ').Er mwyn pennu natur ffisegol y staen AJ estynedig hwn, archwiliwyd ffiniau celloedd ar wyneb apigol-basal celloedd U2OS SPECC1L-kd trwy ficrosgopeg electron trawsyrru (TEM) (Ffigur 3I, J).Mewn cyferbyniad â chelloedd rheoli (Ffig. 3I), a oedd â rhanbarthau electron trwchus ar wahân yn arwydd o AJ (saethau), dangosodd celloedd kd (Ffig. 3J) ranbarthau mawr, cyffiniol o ddwysedd electronau uchel sy'n arwydd o AJ ar hyd yr awyren apicobasal..Yn ogystal, ar adrannau traws, rydym yn arsylwi plygiadau cellbilen helaeth mewn celloedd kd (Ffig. S1 A, B), sy'n esbonio'r patrwm estynedig o β-catenin ac E-cadherin staenio bandiau (Ffig. 3 F, H).I gefnogi rôl SPECC1L yn AJs, roedd β-catenin yn cyd-immunoprecipitated gyda SPECC1L mewn lysates o gelloedd U2OS cydlif (Ffig. 3K).Ynghyd â gwrthimiwnedd estynedig ar gyfer marcwyr AJ, roedd dadansoddiad TEM yn gyson â'n rhagdybiaeth bod diffyg SPECC1L yn cynyddu dwysedd ac amrywiant apigol-sylfaenol AJ.
(AH) Mwy o staen F-actin mewn celloedd kd ar ôl 48 awr ar ôl ymasiad (T6; A, B).Newid staenio myosin IIb sy'n gysylltiedig â F-actin (C, D).Gwellwyd y patrwm llyfn o staenio bilen β-catenin ac E-cadherin mewn celloedd rheoli (E, G) mewn celloedd SPECC1L-kd (F, H).Bariau = 10 µm.(I-J) Micrograffau electron yn arsylwi'r gyffordd rynggellog apigol-waelodol.Mae celloedd rheoli yn dangos rhanbarthau electron-drwchus gwahanol sy'n nodi cyffyrdd gludiog (I, saethau).Mewn cyferbyniad, roedd y gyffordd apical-basal gyfan mewn celloedd SPECC1L-kd yn ymddangos yn drwchus electron (J, saethau), gan nodi dwysedd cynyddol a gwasgariad cyffyrdd gludiog.(K) Roedd β-catenin wedi'i gyd-imiwnedd â SPECC1L mewn lysadau celloedd U2OS cydlif.Delwedd wedi'i thynnu o un man yn cynrychioli un o bedwar arbrawf annibynnol.
Er mwyn deall rôl SPECC1L mewn morffogenesis creuanwynebol, fe wnaethom greu model llygoden diffygiol Specc1l gan ddefnyddio dwy linell gell trap ES annibynnol, DTM096 a RRH048 (BayGenomics, CA), sy'n cynrychioli intron 1 a chafodd trawsgrifiadau Specc1l eu dal yn 15 ( Ffig. 1 ) .4A, ffigur S2).Pennwyd lleoliad genomig y mewnosodiad fector decoy gan ddilyniant genom cyfan a'i gadarnhau gan PCR (Ffig. S2).Roedd y ddau gynllun trap genynnau hefyd yn caniatáu ymasiad mewn ffrâm o'r gohebwyr Specc11-lacZ wrth eu dal.Felly, defnyddiwyd mynegiant lacZ a bennwyd gan staenio X-gal fel dangosydd mynegiant Specc11.Roedd y ddau alel yn dangos patrymau mynegiant lacZ tebyg, gyda'r trap genyn DTM096 yn intron 1 yn dangos mynegiant cryfach na RRH048 yn intron 15 (heb ei ddangos).Fodd bynnag, mae Specc1l yn cael ei fynegi'n eang, gyda mynegiant arbennig o gryf yn y plygiadau niwral yn E8.5 (Ffigur 4B), yn y tiwb niwral a'r prosesau wyneb yn E9.5 ac E10.5 (Ffigur 4C, D), ac wrth ddatblygu breichiau a choesau. yn E10.5 a llygaid (Ffigur 4D).Fe wnaethom adrodd yn flaenorol fod mynegiant SPECC1L yn y bwa pharyngeal cyntaf yn E10.5 yn bresennol yn yr epitheliwm a mesenchyme18 gwaelodol, yn gyson â llinach CNCC.Er mwyn profi mynegiant SPECC1L yn CNCC, gwnaethom berfformio plygiadau niwral E8.5 (Ffigur 4E-J) ac adrannau penglog E9.5 (Ffigur 4K-).Ar E8.5, SPECC1L staenio plygiadau niwral ddwys (Ffig. 4E, H), gan gynnwys celloedd staenio gyda marcwyr NCC (Ffig. 4 G, J).Ar E9.5, SPECC1L (Ffig. 4K, N) staenio cryf mudo CNCC cyd-staenio gyda AP2A (Ffig. 4L, M) neu SOX10 (Ffig. 4O, P).
(A) Cynrychiolaeth sgematig o'r genyn Specc11 llygoden yn dangos mewnosod fector decoy yn ES DTM096 (mewntron 1) a RRH048 (mewntron 15) clonau cell.(BD) staen lacZ o embryonau heterosygaidd Specc1lDTM096 yn cynrychioli mynegiant Specc1l o E8.5 i E10.5.NE = niwroectoderm, NF = plyg niwral, PA1 = bwa pharyngeal cyntaf.(EP) gwrthimiwnedd SPECC1L gyda marcwyr NCC AP2A a SOX10 mewn plygiadau niwral E8.5 (NF; EJ) ac adrannau penglog E9.5 (KP).Gwelwyd staenio SPECC1L yn eang mewn plygiadau niwral E8.5 (E, H; pennau saethau), gan gynnwys celloedd wedi'u labelu ag AP2A (F, G; pennau saethau) a SOX10 (I, J; pennau saethau).Ar E9.5, SPECC1L staen cryf mudo CNCCs (K, N; saethau) labelu AP2A (L, M; saethau) a SOX10 (O, P; saethau).
Mae croesi rhwng Specc1lDTM096/+ heterosygaidd a llygod Specc1lRRH048/+ yn dangos nad yw'r ddau alel trap genyn yn gyflenwol a bod heterosygotau cyfansawdd a homosygotau embryonig ar gyfer y naill alel trap genyn neu'r llall yn embryonig angheuol (Tabl S1).Roedd cymarebau Mendelaidd yn dangos gostyngiad yng nghyfradd goroesi heterosygotau adeg geni (disgwylir 1.34 o'i gymharu â 2.0).Nodwyd nifer isel o farwolaethau amenedigol ymhlith heterosygotau, roedd gan rai anomaleddau creuanwynebol (Ffig. S3).Fodd bynnag, mae treiddiad isel y ffenoteipiau creuanwynebol amenedigol hyn yn ei gwneud hi'n anodd astudio eu mecanweithiau pathoffisiolegol sylfaenol.Felly, fe wnaethom ganolbwyntio ar ffenoteip angheuol embryonig mutants homosygaidd Specc11.
Ni ddatblygodd y rhan fwyaf o embryonau mutant heterosygaidd neu homosygaidd Specc1lDTM096/RRH048 ar ôl E9.5-10.5 (Ffig. 5A-D), ac ni gaeodd y tiwb niwral o'r blaen (Ffig. 5B, D) ac weithiau caeodd yn ôl (heb ei ddangos) ..Roedd y diffyg cau tiwb niwral cranial hwn yn gysylltiedig â'r rhan fwyaf o'r CNCC a farciwyd DLX2 yn weddill yn y plygiadau niwral yn E10.5, sy'n dangos dim dyraniad (Ffigur 5A'-D').Er mwyn penderfynu a oedd maint cyffredinol CNCC hefyd wedi'i leihau, gwnaethom dagio llinellau CNCC gyda GFP yn ein llinellau trap genynnau gyda Wnt1-Cre a ROSAmTmG.Rydym yn ffrydio GFP + NCC wedi'u didoli a GFP- (RFP +) nad ydynt yn NCC o embryonau cyfan.Yn E9.5, nid oedd cyfran y CNCCs wedi'u labelu â GFP wedi'u didoli yn llif yn newid yn sylweddol rhwng WT a embryonau mutant (heb eu dangos), gan nodi manyleb CNCC arferol.Felly, rhagdybiwyd gennym fod staenio Wnt1-Cre a DLX2 gweddilliol mewn plygiadau niwral agored (Ffigur 5B') o ganlyniad i haenu CNCC diffygiol, o bosibl oherwydd dwysedd uwch neu wasgariad celloedd AJ, fel y gwelir mewn celloedd SPECC1L-kd.Fe wnaethom ddefnyddio'r marcwyr NCC SOX10, AP2A, a DLX2 i gadarnhau presenoldeb CNCC yn y plyg niwral (Ffigur 5E-R).Ar E8.5, arsylwyd staenio plygiad niwral ar gyfer y tri marciwr NCC mewn adrannau o WT (Ffig. 5E, G, I) a mutant Specc1l (Ffig. 5F, H, J).Ar E9.5, tra bod marcwyr NCC staen mudo NCC mewn adrannau WT (Ffig. 5M, O, Q), NCC gweddilliol staenio Gwelwyd mewn plygiadau niwral agored o embryonau mutant Specc1l (Ffig. 5N, P, R).Oherwydd bod SOX10 a DLX2 yn nodi CNCCs mudo, mae'r canlyniad hwn yn awgrymu bod CNCCs diffygiol SPECC1L yn cyflawni manyleb ôl-fudo ond yn methu â mudo o blygiadau niwral.
Mae diffyg Specc11 yn arwain at gau tiwb niwral diffygiol, dadlaminadu celloedd crib niwral cranial ac AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryo yn cario celloedd crib niwral cranial mudol (CNCC) wedi'u labelu â Wnt1-Cre (A').Mewn cyferbyniad, mae embryonau mutant Specc11 yn dangos plygiadau niwral agored (B), pennau saethau) a CNCCs nad ydynt wedi mudo (B', pennau saethau).(C, D') Delweddau maes llachar (C, D') a gwrthimiwnedd (C', D') o'r marciwr CNCC DLX2 o embryonau E10.5 WT (C, C') a Specc1l (D, D').Yn embryonau WT E10.5, mae CNCC DLX2-positif yn cytrefu'r bwâu tagell (C', saethau), tra mewn mutants, mae staenio amlwg yn parhau yn y plygiadau niwral agored (D', saethau) ac yn y bwâu pharyngeal cyntaf (D', saethau).) gyda pheth staenio (saethau) yn dynodi dadlaminiad gwael a mudo CNCC.ER) Cafodd adrannau o embryonau mutant WT a Specc1l yng nghamau E8.5 (E-L) ac E9.5 (M-R) eu labelu â marcwyr NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) a DLX2 (I, J, Q, R).Yn E8.5, gwelwyd staenio NCC mewn rhannau plyg niwral gwyllt (NF) a mutant.Datgelodd cyd-staenio SOX10 a β-catenin yn E8.5 WT (K) a mutant (L) gynnydd mewn staen β-catenin ar ffiniau celloedd yn y plygiadau niwral.Yn E9.5, gwelwyd staenio math gwyllt o CNCCs mudol (M, O, Q), tra mewn mutants, roedd CNCCs anhaenedig yn staenio plygiadau niwral agored (N, P, R).(S–Z) Dadansoddiad labelu in vivo AJ mewn adrannau coronaidd o embryonau WT a Specc11DTM096/RRH048 gyda'r treiglad E9.5.Dangosir plân adrannol fras yn y gornel dde uchaf.Mewn rhannau o feinweoedd mutant, gwelwyd mwy o staenio F-actin (S, T) a myosin IIb (U, V).Yn debyg i'r canlyniadau in vitro yn Ffig. 3, mewn embryonau mutant, arsylwyd staenio pilen gwell ar gyfer β-catenin (W, X) ac E-cadherin (Y, Z).(AA-BB) Mae micrograff electron o adran o embryo math gwyllt yn edrych y tu hwnt i ffin y gell apigol-waelodol yn dangos rhanbarth electron-drwchus penodol sy'n arwydd o gyffyrdd gludiog (AA, saethau).Mewn cyferbyniad, mewn adrannau o embryonau mutant Specc11 (BB, saethau), mae'r gyffordd apicobasal gyfan yn electron drwchus, sy'n dangos dwysedd cynyddol a gwasgariad cyffyrdd gludiog.
Er mwyn profi ein rhagdybiaeth bod haenu llai o ganlyniad i newid AJ, fe wnaethom archwilio labelu AJ mewn plygiadau niwral agored o embryonau mutant Specc1l (Ffig. 5S-Z).Gwelsom gynnydd mewn ffibrau straen actin (Ffig. 5S, T) a lleoleiddio cynyddol cydredol o staenio myosin IIB ar ffibrau actin (Ffig. 5U, V).Yn bwysig, gwelsom fwy o staenio β-catenin (Ffig. 5W, X) ac E-cadherin (Ffig. 5Y,Z) ar ffiniau rhynggellog.Fe wnaethom hefyd archwilio staenio β-catenin o NCC ym mhlygiadau niwral embryonau E8.5 (Ffig. 5K, L).Roedd yn ymddangos bod staenio β-catenin yn gryfach mewn plygiadau niwral mutant Specc1l (Ffig. 5L a K), gan awgrymu bod newidiadau AJ wedi dechrau.Mewn micrograffau electron o adrannau penglog o embryonau E9.5, gwelsom eto gynnydd mewn staenio electron-trwchus gwasgaredig mewn embryonau mutant Specc1l o'i gymharu â WT (Ffig. 5AA, BB a S1E-H).Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn cefnogi ein canlyniadau in vitro mewn celloedd U2OS SPECC1L-kd ac yn awgrymu bod staenio AJ aberrant yn rhagflaenu haeniad CNCC yn ein embryonau mutant.
O ystyried y berthynas elyniaethus hysbys rhwng gweithgaredd AKT a sefydlogrwydd E-cadherin,17,28 rhagdybiwyd cyfranogiad signalau PI3K-AKT.Yn ogystal, gwelsom bothellu subepidermal yn rhai o'n embryonau mutant a oedd yn dianc rhag marwoldeb (<5%) yn E9.5-10.5 ac yn lle hynny setlo tua E13.5 (Ffig. S3).Mae fesiglau isepidermol yn nodwedd o signalau PI3K-AKT gostyngol yn seiliedig ar PDGFRα12.Mae Fantauzzo et al.(2014) fod tarfu ar actifadu PI3K sy'n seiliedig ar PDGFRα mewn embryonau mutant PdgfraPI3K/PI3K yn arwain at fesiglau isepidermol, diffygion tiwb niwral, a ffenoteipiau taflod hollt.Yn wir, gostyngwyd lefelau pan-AKT a Ser473-AKT ffosfforylaidd gweithredol mewn vivo mewn meinweoedd mutant Specc1l i arestiad embryonig E9.5 (Ffig. 6A-D).Gall y gostyngiad mewn lefelau ffosfforyleiddiad Ser473-AKT fod yn gyfan gwbl oherwydd y gostyngiad mewn lefelau pan-AKT in vivo (FIG. 6E) ac in vitro (FIG. 6F).Dim ond pan oedd celloedd U2OS yn cydlifo'n gryf â newidiadau mewn siâp celloedd a dwysedd AJ (Ffigur 6D) y gwelwyd gostyngiad in vitro.Felly, mae ein data yn awgrymu bod SPECC1L yn rheolydd cadarnhaol newydd ar gyfer signalau PI3K-AKT mewn morffogenesis creuanwynebol.
(A-E) E8.5 (A,B) ac E9.5 (C,D) adrannau penglog neu lysates E9.5 o embryonau mutant Specc1l (E) yn dangos lefelau o ffosfforyleiddiad gweithredol S473-AKT a gostyngiad Protein pan-AKT , o'i gymharu â rheoli WT.Perfformiwyd blotio gorllewinol ar lysates gwyllt a lysadau mutant o dan yr un amodau.Cymerwyd y delweddau a ddangosir ar gyfer SPECC1L o un cam.Cafodd yr un blot ei dynnu a'i ail-archwilio gyda gwrthgyrff gwrth-pan-ACT ac β-actin.Gostyngwyd lefelau pan-AKT mewn plygiadau niwral E8.5 (A, B) a lefelau ffosfforyleiddiad S473-AKT yn adrannau penglog E9.5 yn sylweddol.(F) Yn yr un modd, gostyngwyd lefelau Pan-AKT mewn lysadau o gelloedd U2OS SPECC1L-kd a gynaeafwyd ar gydlifiad uchel.Mae bariau gwall yn cynrychioli SEMs o dri meintioliad blotiau Gorllewinol annibynnol.(GJ) Adrannau o embryonau WT yn E9.5 wedi'u staenio â KI67 a caspase hollt 3, yn y drefn honno, yn dangos amlhau celloedd (G, G') ac ychydig o weithgaredd apoptotig (H, H').Mae embryonau mutant Specc11 yn dangos amlhau celloedd tebyg (I), ond mae nifer y celloedd sy'n cael apoptosis yn cynyddu'n sylweddol (J).
Yna fe wnaethom archwilio marcwyr amlhau ac apoptosis.Ni wnaethom arsylwi unrhyw wahaniaeth yn nifer yr embryonau E9.5 (Ffig. 6E, G o gymharu ag I) gyda mynegai amlhau o 82.5% ar gyfer mutants WT a 86.5% ar gyfer mutants Specc1l wedi'i fesur gan staenio KI67 (p <0.56, Fisher's prawf union).Yn yr un modd, ni wnaethom arsylwi unrhyw wahaniaeth mewn apoptosis a fesurwyd gan staenio ar gyfer caspase hollt 3 mewn plygiadau niwral yn E8.5 nes arestio embryo (heb ei ddangos) (heb ei ddangos).Mewn cyferbyniad, cynyddwyd apoptosis yn sylweddol ym mhob embryonau mutant E9.5 (Ffig. 6F, H a J).Mae'r cynnydd cyffredinol hwn mewn apoptosis yn gyson â llai o signalau PI3K-AKT a marwoldeb embryonig cynnar29,30,31.
Nesaf, i gadarnhau rôl achosol ar gyfer signalau PI3K-AKT mewn newidiadau AJ yn ein celloedd kd, gwnaethom newid yn gemegol y llwybr mewn celloedd rheoli a kd (Ffigur 7A-F).Fe wnaethom ddefnyddio fel marciwr y ffenoteip newid siâp celloedd a welwyd mewn celloedd SPECC1L-kd cydlif, y gwnaethom eu meintioli gan ddefnyddio cymhareb y dimensiwn hiraf (hyd) i'r dimensiwn fertigol cyfatebol (lled).Disgwylir cymhareb o 1 ar gyfer celloedd cymharol grwn neu giwboidol (Ffigur 7G).Yn ogystal â siâp cell, rydym hefyd yn cadarnhau yr effaith ar AJ gan β-catenin staenio (Ffig. 7A'-F ').Roedd atal y llwybr PI3K-AKT gan ddefnyddio wortmannin yn ddigon i newid siâp celloedd mewn celloedd rheoli (Ffigur 7A, C) ac AJ (Ffigur 7A ').Nid oedd activator PI3K-AKT SC-79 yn effeithio ar siâp celloedd (FIG. 7A, E) nac ehangu AJ (FIG. 7A ') mewn celloedd rheoli.Mewn celloedd SPECC1L-kd, arweiniodd ataliad pellach ar y llwybr PI3K-AKT at fwy o apoptosis (Ffig. 7B, D) a chynnydd amlwg mewn staenio β-catenin (Ffig. 7 B '), yn gyson â'n mutants trwm in vivo.Yn bwysig, roedd gweithrediad y llwybr PI3K-AKT wedi gwella siâp celloedd yn sylweddol (Ffigur 7B, F) a ffenoteipiau AJ (Ffigur 7B ”).Mesurwyd newidiadau mewn siâp celloedd fel cymhareb roundness cell (CCR) a'u cymharu ar gyfer arwyddocâd fel y disgrifir uchod (FIG. 7G).Yn wir, mewn celloedd rheoli (Ffig. 7G, CCR = 1.56), roedd triniaeth wortmannin yn ddigonol i newid siâp y gell yn sylweddol (Ffig. 7G, CCR = 3.61, p < 2.4 × 10-9) i'r graddau tebyg i'r un a arsylwyd yn SPECC1L.-kd celloedd (Ffig. 7G, CCR = 3.46).Nid oedd triniaeth Wortmannin o gelloedd SPECC1L-kd (Ffig. 7G, CCR = 3.60, dibwys) yn fwy arwyddocaol na chelloedd kd heb eu trin (Ffig. 7G, CCR = 3.46, dibwys) neu gelloedd rheoli wedi'u trin â wortmannin (Ffig. 7G)., CCR = 3.46, dibwys) hefyd yn effeithio ar elongation cell (7G, CCR = 3.61, dibwys).Yn bwysicaf oll, adferodd actifydd SC-79 AKT y ffenoteip hirfaith o gelloedd SPECC1L-kd (Ffig. 7G, CCR = 1.74, p < 6.2 × 10-12).Mae'r canlyniadau hyn yn cadarnhau bod SPECC1L yn rheoleiddio signalau PI3K-AKT ac yn awgrymu bod gostyngiad cymedrol mewn SPECC1L yn effeithio ar adlyniad celloedd, tra bod gostyngiad cryf yn arwain at apoptosis (Ffig. 8).
(A-F') Celloedd rheoli (A, C, E) a SPECC1L-kd (B, D, F) wedi'u trin ag atalydd llwybr PI3K-AKT wortmannin (C, D) neu ysgogydd SC-79 (E, F) Triniaeth Mae celloedd rheoli heb eu trin yn giwboidol (A) gyda staenio cellog β-gath arferol (A '), tra bod celloedd kd yn hirgul (B) gyda mwy o staen β-gath (B').Ar ôl atal y llwybr PI3K-AKT, roedd celloedd rheoli yn ymestyn (C) gydag ehangiad β-gath (C'), tra bod celloedd kd wedi dechrau cael apoptosis (D), yn debyg i'n embryonau hynod dreigledig ac yn dangos β-gath hynod well.staenio (D').Ar ôl actifadu'r llwybr PI3K-AKT, arhosodd celloedd rheoli yn giwboidol (E) ac roedd ganddynt staen β-cat (E ') arferol, tra bod celloedd kd yn dangos staenio siâp celloedd (F) a β-cat (F') wedi gwella'n sylweddol, gan nodi (G) Mesurwyd graddau'r newid siâp celloedd yn (AF) gan ddefnyddio cymhareb roundness cell (CCR) y dimensiwn hiraf (hyd) a'r dimensiwn fertigol cyfatebol (lled) gan ddefnyddio meddalwedd MetaMorph.Roedd celloedd SPECC1L-kd heb eu trin (CCR = 3.46) yn sylweddol hirach na chelloedd rheoli (CCR = 1.56, p < 6.1 × 10-13).Roedd ataliad Wort o'r llwybr PI3K-AKT mewn celloedd rheoli yn ddigon i achosi ehangiad tebyg mewn siâp celloedd (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).Yn yr un modd, adferodd activation AKT gan SC-79 mewn celloedd SPECC1L-kd ehangiad celloedd i lefelau rheoli (CCR = 1.74, p < 6.2 × 10-12).Arweiniodd triniaeth Wortmannin o gelloedd SPECC1L-kd at apoptosis cynyddol ond ni welwyd cynnydd pellach mewn newid siâp celloedd (CCR = 3.60) o'i gymharu â kd heb ei drin (CCR = 3.46, ns) neu gelloedd rheoli a driniwyd â wortmann (3.61) a arsylwyd yn .ns = dim ots.+/- Dangosir mesuriadau SEM ar gyfer 50 o gelloedd.Cyfrifwyd gwahaniaethau ystadegol gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr.
(A) Cynrychiolaeth sgematig o ataliad a gweithrediad y llwybr PI3K-AKT gan arwain at newidiadau AJ ac achub, yn y drefn honno.(B) Model arfaethedig ar gyfer sefydlogi protein AKT gan SPECC1L.
Mae CNCC cynfudol yn ei gwneud yn ofynnol i AJ lysis wahanu oddi wrth gelloedd niwroepithelial plyg niwral blaenorol1,15,32.Mae mwy o staenio cydrannau AJ a cholli dosbarthiad anghymesur AJ apigol-sylfaenol mewn celloedd diffygiol SPECC1L in vitro ac in vivo, ynghyd ag agosrwydd ffisegol SPECC1L i β-catenin, yn awgrymu bod SPECC1L yn gweithredu i gynnal sefydlogrwydd lleol AJ yn iawn ar gyfer cyhyrau sefydliad.cytoskeleton actin.Mae cysylltiad SPECC1L â'r cytoskeleton actin ac β-catenin a'r cynnydd yn nifer y ffilamentau actin cyddwys yn absenoldeb SPECC1L yn gyson â'r cynnydd a welwyd yn nwysedd AJ.Posibilrwydd arall yw bod nifer cynyddol o ffibrau actin mewn celloedd diffygiol SPECC1L yn arwain at newid mewn tensiwn rhynggellog.Oherwydd bod straen cellog yn effeithio ar ddeinameg AJ 33, gall newidiadau foltedd arwain at AJ mwy gwasgaredig 34 .Felly bydd unrhyw newidiadau yn effeithio ar haenau CNCC.
Mynegir Wnt1 yn y plygiadau niwral cynnar sy'n achosi celloedd crib niwral.Felly, mae olrhain llinach Wnt1-cre yn nodi cyn ac yn mudo NCC35.Fodd bynnag, mae Wnt1 hefyd yn nodi clonau meinwe dorsal yr ymennydd sydd hefyd yn deillio o blygiadau niwral cynnar 35,36 , gan ei gwneud hi'n debygol nad CNCC yw ein staenio o mutants E9.5 ar gyfer marcwyr Wnt1 mewn plygiadau niwral agored.Cadarnhaodd ein staenio cadarnhaol ar gyfer y marcwyr NCC AP2A a SOX10 fod plygiadau niwral agored embryonau mutant Specc11 yn wir yn cynnwys CNCC.Yn ogystal, gan fod AP2A a SOX10 yn farcwyr o NCC sy'n mudo'n gynnar, roedd staenio cadarnhaol yn dangos bod y celloedd hyn yn CNCC ôl-fudol na ellir eu haenu gan E9.5.
Mae ein data yn awgrymu bod rheoleiddio moleciwlaidd AJ gan SPECC1L yn cael ei gyfryngu gan signalau PI3K-AKT.Gostyngir signalau AKT mewn celloedd a meinweoedd diffygiol SPECC1L.Canfyddiadau gan Fantauzzo et al.cefnogi rôl uniongyrchol ar gyfer signalau PI3K-AKT mewn morffogenesis creuanwynebol.(2014) yn dangos bod diffyg actifadu signalau PI3K-AKT seiliedig ar PDGFRα yn arwain at ffenoteip taflod hollt.Rydym hefyd yn dangos bod atal y llwybr PI3K-AKT yn ddigon i newid siâp AJ a chelloedd mewn celloedd U2OS.Yn gyson â'n canfyddiadau, mae Cain et al.Dangosodd 37 fod is-reoleiddio is-uned PI3K α110 mewn celloedd endothelaidd yn arwain at gynnydd tebyg mewn staenio β-catenin pericellular, y cyfeirir ato fel cynnydd yn y “mynegai cysylltedd”.Fodd bynnag, mewn celloedd endothelaidd y mae eu ffilamentau actin eisoes yn drefnus iawn, mae atal y llwybr PI3K-AKT yn arwain at siâp celloedd rhydd.Mewn cyferbyniad, dangosodd celloedd U2OS SPECC1L-kd siâp cell hirgul.Gall y gwahaniaeth hwn fod yn benodol i fath cell.Er bod ataliad signalau PI3K-AKT yn effeithio'n barhaol ar y cytoskeleton actin, mae'r effaith ar siâp celloedd yn cael ei bennu gan newidiadau mewn tensiwn a achosir gan newidiadau yn nwysedd a threfniadaeth ffibrau actin canolog.Mewn celloedd U2OS, dim ond newidiadau siâp celloedd a ddefnyddiwyd gennym fel marciwr newid ac adferiad AJ diffygiol SPECC1L.I gloi, rydym yn damcaniaethu bod atal y llwybr AKT mewn diffyg SPECC1L yn cynyddu sefydlogrwydd AJ ac yn lleihau dadlaminiad yn CNCC.
Yn ddiddorol, gostyngwyd lefelau pan-AKT in vitro ac in vivo yn ogystal â lefelau ffosfforyleiddio 473-AKT yn absenoldeb SPECC1L, gan awgrymu rheoleiddio signalau PI3K-AKT ar lefel sefydlogrwydd neu drosiant protein AKT.Mae'r genynnau SPECC1L a MID1, y ddau yn gysylltiedig â syndrom Opitz/GBBB, yn amgodio proteinau sy'n sefydlogi microtiwbiau 18,22 .Nid yw'r mecanwaith ar gyfer sefydlogi microtiwbwl cyfryngu SPECC1L a MID1 yn cael ei ddeall yn llawn.Yn achos SPECC1L, mae'r sefydlogi hwn yn cynnwys asetyleiddiad uwch o is-set o ficrodiwbylau 18 .Mae'n bosibl bod SPECC1L yn defnyddio mecanwaith tebyg i sefydlogi proteinau eraill fel AKT.Dangoswyd bod asetyleiddiad gweddillion lysin yn y protein AKT yn arwain at ostyngiad mewn lleoleiddio pilen a ffosfforyleiddiad38.Yn ogystal, mae angen hollbresennol y gadwyn K63 ar yr un gweddillion lysin ar AKT ar gyfer lleoleiddio ac actifadu'r bilen39,40.Ymhlith nifer o ffactorau sy'n rhyngweithio â phroteinau SPECC1L a nodwyd mewn amrywiol sgriniau dau-hybrid burum trwybwn uchel, mae pedwar - CCDC841, ECM2942, APC ac UBE2I43 - wedi'u cysylltu â throsiant neu sefydlogrwydd protein trwy hollbresennoldeb neu symyleiddiad.Efallai y bydd SPECC1L yn ymwneud ag addasiad ôl-gyfieithiad o weddillion lysin AKT, gan effeithio ar sefydlogrwydd AKT.Fodd bynnag, mae rôl hanfodol SPECC1L yn lleoleiddio a sefydlogrwydd y protein AKT i'w egluro o hyd.
Arweiniodd diffygion difrifol mewn mynegiant SPECC1L in vivo at fwy o staenio marciwr AJ a throshaeniad CNCC diffygiol, yn ogystal â mwy o apoptosis a marwoldeb embryonig cynnar.Mae adroddiadau blaenorol wedi dangos bod mutants llygoden â lefelau uwch o apoptosis yn gysylltiedig â namau tiwb niwral 44,45,46,47 a namau creuanwyneb48.Awgrymwyd y gallai marwolaeth celloedd gormodol yn y plygiadau niwral neu fwâu pharyngeal arwain at nifer annigonol o gelloedd sydd eu hangen ar gyfer symudiad morffogenetig priodol 48,49,50.Mewn cyferbyniad, dangosodd ein llinellau celloedd diffygiol SPECC1L gyda mynegiant SPECC1L cymharol lai o newidiadau AJ yn unig heb dystiolaeth o fwy o farwolaethau celloedd.Fodd bynnag, arweiniodd ataliad cemegol y llwybr PI3K-AKT yn y celloedd Kd hyn at fwy o apoptosis.Felly, mae gostyngiad cymedrol mewn mynegiant neu swyddogaeth SPECC1L yn sicrhau goroesiad celloedd.Mae hyn yn gyson â'r sylw bod embryonau mutant Specc11 prin sy'n dianc rhag cael eu harestio yn st.E9.5 - efallai oherwydd llai o effeithlonrwydd dal genynnau - yn gallu cau eu tiwbiau niwral a stopio yn ddiweddarach yn eu datblygiad, yn aml gyda namau creuanwynebol (Ffig. S3).Hefyd yn gyson â hyn mae’r achosion prin o embryonau heterosygaidd Specc1l ag annormaleddau creuanwynebol - yn ôl pob tebyg oherwydd mwy o effeithlonrwydd dal genynnau - yn ogystal â chanfyddiad mewn zebrafish lle mae un o’r ddau ortholog SPECC1L (specc1lb) yn achosi ffenoteipiau embryonig hwyr, gan gynnwys colli enau isaf a holltau dwyochrog51.Felly, gall treigladau colli-swyddogaeth heterosygaidd SPECC1L a nodir mewn cleifion dynol achosi namau bach mewn swyddogaeth SPECC1L yn ystod morffogenesis creuanwynebol, sy'n ddigon i esbonio holltau'r wyneb.Gall rheoleiddio cysylltiadau rhynggellog ar sail SPECC1L hefyd chwarae rhan mewn palatogenesis ac ymasiad bwâu pharyngeal.Bydd astudiaethau pellach o swyddogaeth SPECC1L yn helpu i egluro rôl cysylltiadau rhynggellog dros dro yn CNCC yn ystod cau tiwb niwral mewn symudedd celloedd niwroepitheliaidd a morffogenesis creuanwynebol.
Mae rheolaeth osteosarcoma U2OS a chelloedd SPECC1L-kd wedi'u disgrifio'n flaenorol (Saadi et al., 2011).Mae gwrthgyrff yn erbyn SPECC1L hefyd wedi'u nodweddu o'r blaen (Saadi et al., 2011).Gwrthgyrff gwrth-β-catenin (cwningen; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (llygoden; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ), MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Caergrawnt, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego) , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Caergrawnt, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67 (1:1000; Technoleg Signalau Cell, Danvers, MA), caspase hollt 3 (1:1000; Technoleg Signalau Cell, Danvers, MA) a β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) fel y disgrifiwyd..Cafodd ffilamentau Actin eu staenio â phalloidin rhodamine Acti-staen (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Cafodd celloedd rheoli U2OS a chelloedd SPECC1L-kd eu meithrin mewn DMEM glwcos uchel safonol wedi'i ategu â serwm buchol ffetws 10% (Life Technologies, Carlsbad, CA).Ar gyfer newidiadau AJ, cafodd celloedd 2 x 105 eu hadu ar wydr a gafodd eu trin â gelatin mochyn 0.1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a'u harsylwi ar gyfer newidiadau mewn siâp celloedd.Casglwyd celloedd ar wahanol bwyntiau amser a nodir: 4 awr ar ôl hadu (t = 1), 24 awr ar ôl hadu (t = 2), cydlifiad heb newid yn siâp cell (t = 3), newid yn siâp cell (t = 4) , 24 h ar ôl newid siâp celloedd (t = 5) a 48 h ar ôl newid siâp celloedd (t = 6) (Ffig. 1, 2, 3).Er mwyn modiwleiddio'r llwybr PI3K-AKT, cafodd celloedd eu meithrin yn y crynodiadau a nodwyd gyda'r atalydd PI3K-AKT wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) neu actifadu SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Roedd y cyfrwng sy'n cynnwys y cemegau yn cael ei newid yn ddyddiol.
Gwnaed recordiadau ffrâm wrth ffrâm ar gelloedd rheoli byw a KD o dan amodau diwylliant arferol, a chasglwyd delweddau cyferbyniad cam bob 10 munud am 7 diwrnod.Cafwyd delweddau gan ddefnyddio microsgop gwrthdro Leica DM IRB a reolir gan gyfrifiadur gyda llwyfan mecanyddol ac amcan 10 × N-PLAN wedi'i gysylltu â chamera QImaging Retiga-SRV.Yn ystod delweddu, cynhaliwyd diwylliannau celloedd ar 37 ° C mewn awyrgylch llaith gyda 5% CO2.
Defnyddiwyd dwy linell gell ES trap genyn DTM096 a RRH048 o'r Ganolfan Adnoddau Mutant Llygoden Ranbarthol (UC Davis, CA) i gynhyrchu llinellau llygoden diffygiol Specc11, dynodedig Specc1lgtDTM096 a Specc1lgtRRH046.Yn gryno, chwistrellwyd celloedd 129/REJ ES i blastocysts C57BL6.Cafodd y llygod gwrywaidd cimerig a ddeilliodd o hyn eu bridio gyda llygod benywaidd C57BL6 i adnabod epil â lliw cot agouti.Defnyddiwyd presenoldeb mewnosodiadau fector trap genynnau i adnabod heterosygotau.Cadwyd llygod ar gefndir cymysg o 129/REJ;C57BL6.Cadarnhawyd lleoliad safle mewnosod y fector trap genetig gan RT-PCR, dilyniannu genom, ac ategu genetig (Ffigur Atodol 1).Er mwyn olrhain llinach y CNCC o lygod dwbl Specc1lGT heterosygaidd, croeswyd llygod ROSAmTmG (#007576) a Wnt1-Cre (#003829) (Labordy Jackson, Bar Harbour, ME) i gynhyrchu'r alel ROSAmTmG ac Wnt1-Cre yn Specc1l embryos mutant.Perfformiwyd yr holl arbrofion mewn llygod yn unol â phrotocolau a gymeradwywyd gan Bwyllgor Gofal a Defnydd Anifeiliaid Sefydliadol Canolfan Feddygol Prifysgol Kansas.
Gosodwyd embryonau (1% fformaldehyd, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) am 60 munud ar dymheredd ystafell.Ar ôl sefydlogi mewn hydoddiant staenio X-gal (5 mM potasiwm ferricyanide, 5 mM potasiwm ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% sodiwm deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Perfformiwyd datblygiad staen ar 37 ° C .° C o fewn 1-6 awr.Cafodd embryonau eu hôl-sefydlu mewn 4% PFA a'u delweddu.
Ar gyfer blotio Gorllewinol, roedd celloedd wedi'u gorchuddio â byffer lysis goddefol (Promega, Fitchburg, WI) wedi'i ategu â chymysgedd o atalyddion proteas HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Cafodd Lysates eu prosesu ar geliau parod 12% polyacrylamid TGX Mini-PROTEAN (Bio-Rad, Hercules, CA) a'u trosglwyddo i bilenni Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Cafodd y pilenni eu rhwystro mewn llaeth 5% mewn PBS yn cynnwys 0.1% Tween.Deorwyd gwrthgyrff dros nos ar 4°C neu am awr ar dymheredd ystafell.Defnyddiwyd adweithydd ECL Femto SuperSignal West (Thermo Scientific, Waltham, MA) ar gyfer cynhyrchu signal.Ar gyfer gwrthimiwnedd, gosodwyd embryonau dros nos mewn 4% PFA/PBS a'u cryoprededig.Cafodd cryosections meinwe eu rhwystro mewn PBS yn cynnwys serwm gafr arferol 1% (Thermo Scientific, Waltham, MA) a 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ac yna deorwyd ar 4 ° C mewn deorydd yn ystod y nos.gyda gwrth-gorff a gwrthgorff eilaidd fflwroleuol (1:1000) am 1 awr ar 4°C.Gosodwyd darnau lliw mewn cyfrwng aur ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) a chafwyd delweddau gwastad gan ddefnyddio microsgop confocal SPE Leica TCS.Perfformiwyd pob immunostaining fel tri arbrawf annibynnol ar cirossections o leiaf dau embryonau mutant.Dangosir arbrawf cynrychioliadol.
Deorwyd celloedd mewn byffer RIPA wedi'i addasu (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glyserol, EDTA 2 mM, ac atalydd proteas HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Yn fyr, roedd lysates wedi'u prepuro â gleiniau magnetig protein G (Life Technologies, Carlsbad, CA) ac yna'n cael eu deor dros nos ar 4 ° C. gyda gwrth-SPECC1L neu IgG protein G gleiniau protein yn cael eu defnyddio i echdynnu SPECC1L a pherfformiwyd blotio Gorllewinol gan ddefnyddio'r gwrth-SPECC1L neu IgG protein protein. gwrthgorff -β-catenin a ddisgrifir uchod Mae'r arbrofion cyd-IP a ddangosir yn gynrychioliadol o bedwar arbrawf annibynnol.
Darparwyd celloedd diwylliedig sefydlog neu feinweoedd embryonig llygoden i'r ganolfan microsgopeg electron yng Nghanolfan Feddygol Prifysgol Kansas.Yn gryno, cafodd samplau eu mewnosod mewn resin EMbed 812 (Electron Microsgopeg Sciences, Fort Washington, PA), wedi'u polymeru dros nos ar 60 ° C, a'u torri'n ddarnau ar 80 nm gan ddefnyddio ultramicrotome Leica UC7 gyda llafn diemwnt.Delweddwyd adrannau gan ddefnyddio microsgop electron trawsyrru JEOL JEM-1400 gyda gwn Lab6 100 kV.
Sut i ddyfynnu'r erthygl hon: Wilson, NR et al.Mae diffyg SPECC1L yn arwain at sefydlogrwydd cynyddol o gymalau sbleis a llai o ddadlamineiddio celloedd cribau cranial cranial.y wyddoniaeth.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Anwythiad a gwahaniaethu'r arfbais niwral.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Mae Cordero, DR et al.Celloedd crib niwral cranial yn symud: eu rôl mewn datblygiad creuanwynebol.American Journal of Medical Genetics.Rhan A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: ei dwf a'i ddatblygiad dros 20 mlynedd.Pediatregydd.patholeg.labordy.meddygaeth.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU a Noten MM Torri tir newydd ym maes geneteg holltau'r wyneb.Tueddiadau mewn Meddygaeth Foleciwlaidd 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. a Riley, FM Mecanweithiau moleciwlaidd mudo celloedd cribog niwral cranial a phatrymu yn ystod datblygiad creuanwynebol.Datblygiad 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH a Murray, JK Cleft gwefus a thaflod: deall dylanwadau genetig ac amgylcheddol.sylw naturiol.Geneteg 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Mae Ingram, CR et al.Morffogenesis annormal y croen, yr aelodau, a'r rhanbarth creuanwynebol mewn llygod diffygiol ffactor-6 (Irf6) sy'n rheoleiddio interfferon.Genette Cenedlaethol.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Mae mwtaniadau dominyddol yn GRHL3 yn achosi syndrom van der Waord ac yn amharu ar ddatblygiad periderm y geg.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ a Juriloff, DM Diweddaru'r rhestr o mutants llygoden gyda diffygion wrth gau tiwb nerfol a chynnydd tuag at ddealltwriaeth enetig gyflawn o gau tiwb niwral.Ymchwilio i namau geni.Rhan A, Teratoleg Glinigol a Moleciwlaidd 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA a Soriano, P. Mae signalau PDGFRalpha wedi'u cyfryngu gan PI3K yn rheoleiddio goroesiad ac ymlediad mewn datblygiad ysgerbydol trwy lwybr mewngellol sy'n dibynnu ar p53.Datblygiad Genynnau 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND a Murdoch, JN Dissheveled: Perthynas ehangiad cydgyfeiriol â chau tiwb niwral.Tueddiadau mewn niwroleg.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).